פרוטוקול זה מספק הגדרות ניסוי לביצוע תרביות דו-ממדיות ותלת-ממדיות ניתנות לשליטה במיקרו-מכשירים כדי לדמיין ולנטר שיחות צולבות בין תאים חיסוניים לגידולים ולנתח את ההשפעות של טיפולים אנטי-סרטניים. טכנולוגיה זו מספקת הדמיה קלה בזמן אמת של גיוס תאי חיסון ואינטראקציות וניתן להשתמש בה עבור דגימות אנושיות ומטופלים. זה תואם לרוב המיקרוסקופים החדישים.
המדגימים את ההליך יהיו פרנצ'סקו נוטו, דוקטורנט במחלקה לאונקולוגיה ורפואה מולקולרית, Istituto Superiore di Sanita, וניקולטה מנדוקה ואסתר מקפאו, דוקטורנטיות באוניברסיטה הקתולית דל סקרו קורה, המחלקה לרפואה תרגומית וכירורגיה. שבבים מופעלים בעבר באמצעות פלזמה בחומר ניקוי פלזמה או במכונת חריטת ברזל תגובתית בחדר נקי. תאי טחול מורין וקו תאי גידול משמשים כאן לחיקוי הפרוטוקולים המתוארים בטקסט.
לפני טעינת מתלי תאים, משוך מדיה מכל ששת המאגרים. ואז לאט לטעון 1 x 10 לתאי הגידול 5 resuspended ב 10 עד 50 מיקרוליטר של מדיום צמיחה במאגר השמאלי העליון ואת הבאר התחתונה. בצד ימין, פיפטה עדינה 1 x 10 לתאי החיסון הצפים 6 מרחפים מחדש ב 50 מיקרוליטר של מדיום צמיחה לתוך שתי בארות.
לאחר הוספת כל התאים, מלאו את כל ששת המאגרים של כל שבב בעד 100 עד 150 מיקרוליטר של מדיום גידול ובדקו שהתאים פוזרו כראוי בתוך כל תא תרבית. דגרו על השבב למשך שעה אחת כדי לאפשר למערכת להתייצב לפני ההקלטה בהילוך מהיר. להדמיית תאים חיים, הרכיבו את החיסון של הגידול על לוחית השבב בשלב המיקרוסקופ.
התאם אישית את הגדרת זרימת העבודה של הרכישה בממשק תוכנת המיקרוסקופ, כגון תוכנת Incucyte Live-Cell Analysis Software. בחר חלונות תצפית, קצב המסגרות האופטימלי ומשך הזמן, בהתאם לפרמטרים המתאימים לניסוי ולסוגי התאים הנחקרים. דמיינו את התאים לפרק הזמן המתאים לניסוי.
הכינו שני אליציטוטים של מטריג'ל מדולל במדיום המכיל תרופה או שילוב של תרופות לשני תנאי הניסוי באמצעות קצוות קרים. תאי גידול מוכתמים בצבע פלואורסצנטי התלויים בעדינות בפיפטה, התלויים בתמיסת מטריצה על קרח כדי להשיג פיזור הומוגני של התאים. עם צלחת השבב על בלוק קירור או על סל עם קרח, להזריק לאט את תמיסת מטריצת תאי הגידול שטופלה בתרופה לתוך יציאות הג'ל השמאלי והימני באמצעות קצוות מיקרופיפטה קרים של 10 מיקרוליטר.
הפעל לחץ עדין כדי לדחוף את תמיסת המטריצה מצד אחד של הערוץ לצד השני. כאשר כל תאי הגידול הועמסו, הניחו את המכשיר באינקובטור במצב זקוף למשך 30 דקות. בתום הדגירה, לאחר השלמת ג'לציית המטריצה, ממלאים את התעלות הבינוניות של כל ששת המאגרים ב-50 מיקרוליטר של מדיום תרבית.
בדוק את שלמות הג'ל הפולימרי ואת פיזור תאי הגידול תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן מניחים את השבבים באינקובטור עד להשלמת הכנת תאי החיסון. לאחר הדגירה, שואפים את המדיום מכל באר.
הניחו את הקצה ליד פתח התעלה האמצעית והשתמשו בלחץ מתון כדי להזריק בעדינות 10 מיקרוליטר של 10 לתאי החיסון ה-6 המסומנים בצבע פלואורסצנטי מנוגד. הזריקו 50 עד 100 מיקרוליטר של התווך לכל אחת מארבע הבארות של התעלות הרוחביות, 40 עד 90 מיקרוליטר של התווך לתוך הבאר המרכזית העליונה, ו-50 עד 100 מיקרוליטר של התווך לתוך הבאר המרכזית התחתונה. כאשר כל הבארות הועמסו, השתמש במיקרוסקופ כדי לאשר כי התפלגות תאי החיסון נותרה מוגבלת לחדר המרכזי.
לאחר מכן הניחו בזהירות את המכשיר על משטח ישר באינקובטור תרבית התא עד להדמיה. כדי לחשב את היקף תאי החיסון החיים המוכתמים בפלואורסצנטיות החודרים לתאי הגידול, צלם את המכשיר בנקודות זמן ספציפיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי והגדר את פרמטרי המצלמה המתאימים בתוכנת ההדמיה של המיקרוסקופ, כגון Nikon NIS-Elements. כמו כן, הגדר את הפרמטרים עבור תאים חיסוניים מסומנים.
ניתן לעקוב אחר תנועתם של לויקוציטים דרך גשרים מיקרו-ערוציים בנויים כראוי בפלטפורמה המיקרופלואידית לעבר תאי המטרה שלהם באמצעות מיקרוסקופ וידאו. בניתוח מעקב זה, PBMCs בודדים אותגרו עם תאים סרטניים גוססים שטופלו בדוקסורוביצין או חיים שטופלו ב- PBS. ערכי כימוטקסיס רלוונטיים וחלקות נדידה נוצרו באופן אוטומטי, ופרופיל נדידה שונה עבור תאי החיסון נצפה כאשר הם עמוסים יחד עם תאי סרטן השד שנחשפו לדוקסורוביצין או PBS.
כאשר ה-PBMCs נתקלו בתאי סרטן אפופטוטיים, הם חצו מיקרו-ערוצים לעבר התאים הגוועים והמתים, אך לא חצו לתאים חיים ולא מטופלים. חלק קטן של לויקוציטים עם צפיפות גוברת במשך 24 עד 48 שעות הציגו מגעים ארוכי טווח עם תאים סרטניים שטופלו בדוקסו. בניתוח זה, מודל גידול חיסוני תלת-ממדי חדש שימש לכימות גיוס תאי חיסון בתגובה לשילובים אנטי-סרטניים של תרופות אפיגנטיות.
PBMCs המסומנים בצבע אדום הופצו לאחר מכן בצורה הומוגנית לתוך תא הנוזל המרכזי. לאחר מכן הושוותה היכולת של שתי מסות הגידול למשוך את ה-PBMCs, כאשר ה-PBMCs גויסו בניסוי זה למיקרו-ערוץ הימני. עבור מודל 3D, לערבב את הפתרון עם הידרוג'ל ותאים על קרח, הימנעות בועות טרום פילמור.
הזריקו אותו לאט ללא לחץ מוגזם. כוונן את שלבי הפילמור בהתאם למטריצה בה נעשה שימוש. ניתן ליישם בדיקות תאים חיים/מתים ופרופיל הפרשת ציטוקינים מסופרנאטנטים.
ניתן לבצע אימונופלואורסנציה להדמיה קונפוקלית כדי לסווג תת-סוגים חיסוניים ולסמני ביטוי של הפעלה והבשלת תשישות.
