用于剖析体外肿瘤微环境中免疫反应的微流控共培养模型

该协议提供了实验设置，可在微型设备中进行可控制的2D和3D共培养，以可视化和监测肿瘤免疫细胞串扰并分析抗癌治疗的效果。该技术提供免疫细胞募集和相互作用的实时和轻松可视化，可用于人类和患者来源的样本。它与大多数最先进的显微镜兼容。

展示该程序的将是Istituto Superiore di Sanita肿瘤学和分子医学系的博士生Francesco Noto，以及Nicoleta Manduca和Esther Maccafeo，他们是Universita Cattolica del Sacro Cuore的博士生，转化医学和外科系。切屑先前在洁净室的等离子清洗机或反应性铁蚀刻机中进行等离子体活化。这里使用鼠脾细胞和肿瘤细胞系来模拟文中描述的方案。

在加载细胞悬浮液之前，从所有六个储液槽中取出培养基。然后缓慢加载1×10至第5个肿瘤细胞，重悬于左上角储液槽和下孔中的10至50微升生长培养基中。在右侧，轻轻移取1 x 10至第6个浮动免疫细胞，重悬于50微升生长培养基中，放入两个孔中。

添加所有细胞后，用多达100至150微升的生长培养基填充每个芯片的所有六个储液器，并检查细胞是否已正确分布在每个培养室内。将芯片孵育一小时，以使系统在延时记录之前稳定下来。对于活细胞成像，将肿瘤免疫安装在显微镜载物台的芯片板上。

在显微镜软件界面（如Incucyte活细胞分析软件）中自定义采集工作流程设置。选择观察窗口、最佳帧速率和持续时间，具体取决于实验和所研究细胞类型的适当参数。在适当的实验时间段内对细胞进行成像。

使用冷吸头制备两份用含有药物的培养基或药物组合稀释的基质胶，用于两种实验条件。轻轻移液悬浮在冰上基质溶液中的活相容荧光染料染色肿瘤细胞，以获得细胞的均匀分布。将芯片板放在冷却块或装有冰的篮子上，使用冷的10微升微量移液器吸头将药物治疗的肿瘤细胞基质溶液缓慢注射到左右凝胶端口中。

施加温和的压力，将基质溶液从通道的一侧推到另一侧。当所有肿瘤细胞都已加载后，将装置以直立位置放入培养箱中30分钟。在孵育结束时，一旦基质凝胶完成，用50微升培养基填充所有六个储液槽的培养基通道。

在显微镜下检查聚合凝胶的完整性和肿瘤细胞分布。然后将芯片放入培养箱中，直到免疫细胞制备完成。孵育后，从每个孔中吸出培养基。

将尖端放在中间培养基通道的入口附近，并使用适度的压力轻轻地将10微升10微升10分注射到用对比荧光染料标记的第6个免疫细胞中。将 50 至 100 微升培养基注入横向通道的四个孔中的每一个，将 40 至 90 微升培养基注入上部中央孔，将 50 至 100 微升培养基注入下部中央孔。当所有孔都加载完毕后，使用显微镜确认免疫细胞分布是否仅限于中央室。

然后小心地将设备放置在细胞培养箱中的水平表面上，直到成像。要计算荧光染色的活免疫细胞浸润肿瘤区室的程度，请通过荧光显微镜在特定感兴趣的时间点对设备进行成像，并在显微镜成像软件（如尼康NIS-Elements）中设置适当的相机参数。还要设置标记免疫细胞的参数。

白细胞通过微流体平台中适当构建的微通道桥向靶细胞的运动可以通过视频显微镜进行跟踪。在这项跟踪分析中，单个PBMC受到死亡的阿霉素处理或活PBS处理的癌细胞的挑战。自动生成相关的趋化性值和迁移图，当与暴露于阿霉素或PBS的乳腺癌细胞共载时，观察到免疫细胞的不同迁移曲线。

当PBMC面对凋亡癌细胞时，它们穿过微通道走向垂死细胞和死亡细胞，但没有穿过活的，未经处理的细胞。在24至48小时内密度增加的白细胞的一部分表现出与Doxo处理的癌细胞的长期接触。在该分析中，使用一种新的3D免疫功能肿瘤模型来量化免疫细胞的募集，以响应表观遗传药物的抗癌组合。

然后将红色染料标记的PBMC均匀地分布到中央流体室中。然后比较了两个肿瘤肿块吸引PBMC的能力，在该实验中将PBMC强壮地募集到右侧微通道中。对于3D模型，将溶液与冰上的水凝胶和细胞混合，避免气泡和预聚合。

慢慢注射，不要用力过大。根据所使用的基质调整聚合步骤。可以实施活/死细胞测定和上清液的细胞因子分泌分析。

可用于共聚焦成像的免疫荧光可用于对免疫亚型进行分类，并用于激活和衰竭成熟的表达标志物。