הפרוטוקול נועד לדמות בתנאי vivo של ניוון דיסק בין חולייתי כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה שלה ללא צורך במודלים של בעלי חיים. בהשוואה לתרבות תאי במבחנה, טכניקת תרבות האיברים הביוריאקטורית שומרת על התאים במיקרו-ווירון הביולוגי והביומכני הטבעי שלהם בנוסף לאספקת מצב תרבותי ניתן לשליטה ולשחזור. התחל עם שטיפת זנב שור כולו ביסודיות עם מי ברז כדי להסיר לכלוך ושיער על פני השטח, ולאחר מכן לטבול את הזנב בתמיסת 1%betadine במשך 10 דקות כדי לחטא את פני השטח.
השתמש מספר אזמל 20 כדי להסיר את הרקמה הרכה מעמוד השדרה caudal כדי להקל על זיהוי של דיסקים בין חולייתיים, או IVDs. הסר את התהליכים הסיבוביים וה רוחביים של החוליות עם צבת להסרת עצם. חותכים רוחבית עם צבת עצם דרך אמצע כל גוף חולייתי כדי להשיג מקטעי תנועה בודדים, ולאחר מכן לשים את מקטעי התנועה שנאספו בצלחת פטרי עם גזה רטוב בתמיסה של רינגר.
אתר את IVD בחוליות על ידי הזזת מקטעי התנועה בעדינות, ולאחר מכן לזהות את המיקום של צלחת הצמיחה על ידי נגיעה ומציאת הצד הקמור של צלחת הקצה הגרמי. מצננים את הלהב של המסור עם הפתרון של רינגר ומשתמשים בו כדי לבצע שני חתכים מקבילים בצלחת הגדילה של הריוי-די, אחד מכל צד. מעבירים את הריוי-די לצלחת פטרי נקייה עם גזה נקייה רטובה בתמיסה של רינגר.
לגרד את גוף החוליות ואת צלחת הצמיחה באמצעות להב אזמל, משאיר את צלחת הקצה שלם. מקמו את שני המשטחים שטוחים ומקבילים להליך הטעינה והעבירו עירויים מגרדים לצלחת פטרי טרייה עם גזה רטובה בתמיסה של רינגר. למדוד את גובה הדיסק וקוטר עם caliper, ולאחר מכן לנקות את קרישי הדם בעצם החוליות עם הפתרון של רינגר באמצעות מערכת שטיפת סילון.
יש לחטא את הדיסקים החוץ-גופיים ב-PBS ו-10% סטרפטומיצין פניצילין עם רעידות במשך 15 דקות. לשטוף את אנטיביוטיקה בריכוז גבוה עם PBS ו 1% פניצילין סטרפטומיצין. מעבירים דיסקים לתאי IVD המכילים חמישה מיליליטר של מדיום תרבות IVD ומניחים אותם במערכת הביוריאקטור עם אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 85% לחות ו 5% פחמן דו חמצני.
תרבית את הדיסקים במשך ארבעה ימים בתוך מערכת bioreactor על ידי שמירה על תנאי טעינה שונים על פי קבוצות הניסוי. בקבוצת הביקורת הפיזיולוגית, תרבית את IVDs עם מדיום גלוקוז גבוה באמצעות פרוטוקול טעינה של 0.02 כדי 0.2 מגה פסקל ו 0.2 הרץ במשך שעתיים ביום. בקבוצה הפתולוגית, תרבות IVDs עם מדיום גלוקוז נמוך באמצעות פרוטוקול טעינה של 0.32 כדי 0.5 מגה פסקל וחמישה הרץ במשך שעתיים ביום.
בין הליכי הטעינה, מניחים את הפריה חוץ גופית בצלחות שש בארות עם שבעה מיליליטר של מדיום תרבות הפריה חוץ גופית להתאוששות נפיחות חינם. למדוד את גובה הדיסק מדי יום עם קליפר לאחר תקופת הנפיחות החופשית ולאחר טעינה דינמית למשך הניסוי. לאחר מחזור הטעינה הדינמי הראשון ביום הראשון, מניחים ישירות את הריוי-די-די בצלחת פטרי במצב אנכי ומייצבים אותם בפינצטה.
הזרק TNF-אלפא רקומביננטי עם מחט אינסולין 30 מד לאט במהירות של כ 70 microliters לדקה לתוך IVDs של הקבוצה הפתולוגית. לאחר ההזרקה, למשוך את המזרק באמצע הדרך לאחור ולמשוך את הכוכנה כדי ליצור ואקום המונע את הפתרון מוזרק דליפה, ולאחר מכן להסיר את המזרק לחלוטין מן IVD. טעינה ניוונית בשילוב עם אספקת תזונה מוגבלת והזרקת TNF-אלפא גרמו לעלייה משמעותית בביטוי הגנים של סמנים פרו דלקתיים אינטרלוקין שש ואינטרלוקין שמונה ברקמת NP לאחר ארבעה ימים של תרבות.
שחרור החלבון אינטרלוקין שמונה לתוך המדיום הממוזג הראה עלייה ניכרת בקבוצה הפתולוגית ביום השני וביום הרביעי. הפחתת גובה הדיסק לאחר הטעינה הייתה גבוהה יותר בקבוצה הפתולוגית בהשוואה לקבוצה הפיזיולוגית, וההבדלים היו בולטים יותר לאחר ימים יומיים ושלוש בהשוואה ליום הראשון, מה שמצביע על השפעה מתקדמת של התנאים הניווניים והדלקתיים. טכניקת ניתוח סטנדרטית חשובה למודלים של תרבות איברים שלמים IVD הניתנים לשחזור.
ביוריאקטור נדרש ליישם עומסים פיזיולוגיים וניוון על עירויים כדי לדמות תנאים ביומכניים שונים של vivo. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על IVD אנושי explants אשר הוא רלוונטיות קלינית גבוהה. זהו מודל פרה-קליפיני חדשני לפיתוח טיפולים יעילים על ניוון דיסק בשלב מוקדם.
