מודל של הקרנית של הקרניות הפותל באמצעות לחצני הקרנית מפוצלת

פרוטוקול זה מציג את מודל המחקר הראשון המאפשר טיפוח ארוך טווח אורגנוטיפי של תאי אנדותל הקרנית שהושגו עם הכנת כפתורי קרנית מפוצלים. על ידי הסרה חלקית של שכבות הקרנית החיצוניות, אובדן תאי ה אנדותל מצטמצם באופן משמעותי, ומאפשר טיפוח של תאי אנדותל הקרנית לפחות 15 ימים. לכן, מודל זה הוא בעל ערך עבור חקירת ההשפעות של חומרים ספציפיים או טכניקות של עניין כגון פתרונות השקיה או מכשירים viscoelastic עיניים על אנדותל הקרנית.

לאחר קבלת עיני חזיר שהוסרו זמן קצר לאחר המוות, השתמש במספריים לעיניים ומדפים קוליברי כדי להסיר את כל adnexes מסלולית. מניחים חמש עד שש עיניים לתוך חמישה אחוזים יוד PBS פתרון במשך סך של חמש דקות כדי לחטא כראוי את משטחי העין, עם ערבוב זהיר פעם בדקה כדי להבטיח כי המשטחים שקועים לחלוטין כדי להשיג חיטוי מלא. לאחר חמש דקות, להעביר את העיניים חיטוי לתוך PBS טהור, בזהירות מערבבים אותו לשטוף ביסודיות את פתרון יוד PBS מפני העיניים.

לפני תחילת הניתוח, השתמש בקטטר קהה כדי למלא מזרק חמישה מיליליטר עם שני מיליליטר של סרום עגל עוברי מופשר טרי, וסנן את הסרום באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך 80 מיליליטר של מדיום תרבות נטול דקסטרן. בעדינות להתסיס את התערובת כדי להשיג הפצה הומוגנית של הסרום, ולהוסיף שלושה מיליליטר של המדיום לכל באר של צלחת תרבות תאים 12 היטב. כאשר הצלחת מוכנה, להעביר נורת עיניים לתוך מחזיק נורת עיניים תחת מיקרוסקופ כירורגי עיניים עם הקרנית פונה כלפי מעלה, ולהשתמש מזרק מלא 0.9% נתרן כלורי להחיל יניקה קלה על העין על מחזיק הנורה כדי לתקן את העין במקום.

השתמש trephine המכיל שיבוץ מתוקנן לחתוך באופן שטחי לתוך הקרנית המרכזית, לא עמוק יותר מ 300 מיקרומטר, ולהשתמש מדחסי קוליברי אזמל חד-שימוש עם להב משולש לחתוך ולהסיר את שבר trephined חלקית של הקרנית אופקית דרך סטרומה. באופן שטחי מניחים תפר 10-0 לתוך הסטרומה כדי לאפשר התבלות של ה אנדותל מהצד הסטרומאלי במהלך הניסויים, מבלי לחדור את אנדותל הקרנית, ולהשתמש בטרפין ללא שיבוץ כדי לקדם את חתך הטרפין לעומק מלא עד להגיע לתא העין קדמי. ירידה ברורה בהתנגדות ודליפת נוזלים מתא העין לפני הלידה יכולה להיתפס לאחר חדירה מוחלטת של הקרנית.

מניחים את כפתור הקרנית המפוצל המתקבל המכיל חלק מהסטרומה, קרום הדשמט, ואת אנדותל הקרנית לתוך באר אחת של צלחת 12 באר עם הצד המתויג פונה כלפי מטה. ואז לתייג כל באר על צלחת התרבות עם מספר בודד עבור כל כפתור הקרנית מפוצל לזיהוי במהלך מעקב. כאשר נאספו כל כפתורי הקרנית, מניחים את צלחת 12 הבאר באינקובטור של תרבות התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוז פחמן דו חמצני ו-95% לחות, ומחליפים את העל-טבעי ביום השמיני אם חריגה מתמשך שבעה ימים של אינקובציה.

כדי לבצע בדיקה לא מזוהמת, להוסיף שלושה מיליליטר של תווי מלח מאוזנים היפוטוניים לכל באר של צלחת 12 באר, בזהירות למקם כפתור קרנית מפוצל אחד לתוך כל באר כדי לגרום לנפיחות של תאי אנדותל הקרנית, ולשפר את הראות של התאים לספירה. לאחר שעה עד שתי דקות, השתמש במצלמת מיקרוסקופ כדי לרכוש לפחות שלוש תמונות של שלושה אזורים שונים של ה אנדותל כדי לקבל רושם מייצג של המצב בפועל של אנדותל הקרנית, ולהוסיף סרגל קנה מידה עם אורך אמיתי בקנה מידה של 100 מיקרומטר לניתוח מאוחר יותר. כדי למנוע נזק אוסמוטי, להעביר את כפתור הקרנית מפוצל מהפתרון לאחר מקסימום של חמש דקות בחזרה לתוך מדיום התרבות.

כדי לבצע בדיקה מוכתמת, מניחים את כפתורי הקרנית המפוצלים במנות פטרי בודדות, בצד ה אנדותל למעלה, ולהשתמש פיפטה לאט לרדת 0.25% פתרון כחול טריפם על כל אנדותל הקרנית במשך 90 שניות לכל דגימה. לאחר מכן, לשטוף בזהירות את הכפתורים שלוש פעמים ב 0.9% נתרן כלורי ב זכוכית קטנה לפני השימוש פיפטה לאט לרדת 0.2% Alizarin אדום S פתרון על אנדותליה במשך 90 שניות. לאחר מכן תדמיין את הדגימות כפי שהודגם זה בלבד.

כדי להכין את התמונות להערכת צפיפות תאים ומורפולוגיה, פתח את התמונות בתוכנה מתאימה לעריכת גרפיקה והקרן ריבוע עם אורך צד של 100 מיקרומטרים על התמונה. לחיתוך סרגל קנה המידה, השתמשו בכלי כתובית מלבנית כדי להגבל את סרגל קנה המידה ולבחור עריכה וחיתוך. לחץ על קובץ וחדש ובחר לוח.

שים לב לפיקסלים המתאימים עבור התמונות האחרות ולחץ על אישור. לחץ שוב על קובץ וחדש, והוסף את הרוחב והאורך של ריבוע הספירה בפיקסלים בחלון הנפתח בהתאם לאורך סרגל קנה המידה. בחרו 'לבן' כצבע רקע ולחצו על הלחצן 'אשר' לבחירת הכל, והעתיקו את התמונה שנבחרה. בחר את התמונה של אנדותל הקרנית ולהדביק את הריבוע על אנדותל הקרנית.

בחרו בשכבה הריבועית והגדירו את האטימות ל-30%, לחצו על הלחצן 'אשר' וחסכו את התמונה עם הריבוע המוקרן עם אורך שקופית של 100 מיקרומטר. כדי להעריך את צפיפות התא ה אנדותל, פתח את התמונות עם הריבועים המוקרנים ב- ImageJ, ופתח את תוסף מונה התאים. כדי לספור את התאים בתוך הריבוע, לחץ על אתחול כדי לספור את תאי ה אנדותל משני צידי הריבוע ולתרשם את התוצאה.

כדי להעריך את הפרמטרים המורפולוגיים, ספור את המפגש המשותף של לפחות ארבעה תאים לכל גבול תא, את המראה האופייני בצורת רוזטה ואת האזורים האדומים של Alizarin בתוך הריבועים המוקרנים. במשך תקופה של 15 ימים, כפתורי קרנית מפוצלים מדגימים ירידה מתמדת בצפיפות תאי ה אנדותל, עם אובדן תאי אנדותל באחוזים שבועיים ממוצעים של 4.90% כתמים של שכבת התא ה אנדותל ביום 15 מאפשר ניתוח מורפולוגי של תאי הקרנית, עם נתוני רפורמציה המהווים כשבעה אחוזים מגבולות התא המתמזג, חציון של היווצרות רוזט אחת בערך למילימטר מרובע וכ-13 הפסדי תאים דייקניים למילימטר בריבוע. כאן, תמונות מייצגות של אנדותל הקרנית במהלך הערכה מיקרוסקופית בתווית מלח היפוטונית מאוזנת, ולאחר כתמים עם כחול טריפאן ואליזרין אדום S, ניתן לראות.

אם כפתורי הקרנית המפוצלים מעובדים כאשר הצד ה אנדותל פונה כלפי מטה, צפוי נזק נרחב לתאי ה אנדותל. כפתורי הקרנית שאינם מפוצלים סובלים מאובדן תאי אנדותל מוגבר באופן משמעותי עקב נפיחות סטרומה, מה שגורם לקיפול הקרום של Descemet במשך 15 ימים של טיפוח, ואילו כפתורי קרנית מפוצלים מציגים אנדותל קרנית שהשתמר במידה רבה לאחר 15 ימים של טיפוח, כפי שמעידים אזורים מפוזרים של אליעזר אדום מוכתם, המעידים על תאים בודדים שנהרסו. כדי למזער את אובדן התא, יש לדאוג לא לגעת אנדותל הקרנית לאורך כל השלבים של פרוטוקול זה.