פרוטוקול זה יכול לשמש לגילוי ואפיון של דינמיקה קונפורמית של חלבונים, החיוניים להבנת מגוון רחב של תהליכים תאיים. בהשוואה לשיטות אחרות, שיטה זו אינה דורשת שלבי הכנה מדגם מיוחדים ומספקת אפיון מקיף של הקינטיקה, התרמודינמיקה וההיבטים המבניים של שיווי המשקל האישורי. פיזור הרפיה CPMG יכול להיות מיושם באופן נרחב יותר עבור אפיון של דינמיקה אישור חומצות גרעין וביומולקולות אחרות, כמו גם עבור אפיון של אינטראקציות חלקיקי ligand.
הפרוטוקול שלנו מיועד למשתמשי CPMG בפעם הראשונה. אז זו נקודת התחלה טובה. עם זאת, אנו מצפים מהמשתמשים לדעת את השלבים הבסיסיים להפעלת ניסויי NMR קונבנציונליים.
כדי להגדיר ניסוי NMR בפעם הראשונה, הורד תחילה ובטל את ההסתעפות של קבצים משלימים אלה. העתק את הסיביות. vv trosy_15N_CPMG.
vv קבצים בתיקיית תוכנית הדופק לספריית תוכנית הדופק. פתח את תוכנת הרכישה והשתמש בפקודה EDC כדי להעתיק ניסוי חנקן מימן 15 HSQC שנערך בעבר לניסוי חדש. השתמש בפקודה pulse program כדי לטעון את trosy_15N_CPMG.
vv pulse קובץ תוכנית לתוך הניסוי החדש שנוצר. לאחר מכן השתמש בהוראות מסוף קובץ תוכנית הדופק כדי להגדיר את ניסוי CPMG. כדי להגדיר ניסוי NMR שגרתי, הצג את הדגימה למגנט ובצע את כל שלבי הרכישה הבסיסיים של NMR.
הגדר P1 למשך של מימן קשה 90 מעלות פולסים P7 למשך חנקן 15 קשה 90 מעלות פולסים. בחלון הרכישה, להגדיר את המרכז ואת רוחב ספקטרלי עבור מימן וחנקן 15 ממדים. הגדר את השהיית ההרפיה ל- 0.7 T2 והשתמש בפקודה רשימת VC כדי ליצור רשימה של מספרים שלמים התואמים ל- N.After המאשרים כי כל ערך ברשימה תואם לשדה CPMG שונה בהתאם ל- CPMG שהוגש שווה לפי 4N חלקי D30, ודא שהמספר הראשון ברשימה הוא אפס.
הגדר את L8 למספר הערכים ברשימת ה- VC, L3 למספר הנקודות הממשיות עבור הממד העקיף ו- 1TD ל- L8 פעמים L3 כפול שתיים. כדי למטב את דיכוי המים, הגדר את הרווח מקלט אחד וסוג EDC למשוך כדי לפתוח את קובץ תוכנית הדופק. בשורה 91, הסר את הנקודה-פסיק שלפני goto 999 ושמור את הקובץ.
באמצעות הפקודה GS, התאם את הפרמטרים SPDB0 כדי למזער את עוצמת אות ה- FID. כאשר עוצמת האות שונתה, הצג מחדש נקודה-פסיק בשורה 91 של קובץ תוכנית הדופק ושמור את הקובץ. כדי למטב את SPDB11, הגדר את הרווח של המקלט לאחד ואת סוג המשיכה של EDC כדי לפתוח את קובץ תוכנית הדופק.
בשורה 168, הסר את נקודתיים הנקודה-פסיק שלפני goto 999 ושמור את הקובץ. באמצעות הפקודה GS, התאם את הפרמטרים SPDB11 כדי למזער את עוצמת אות ה- FID. לאחר שינוי עוצמת האות, הצג מחדש את נקודתיים-פסיק בקו 168 ושמור את הקובץ.
כדי למטב את SPDB2, הגדר את רווח המקלט לאחד והזן משיכה EDC כדי לפתוח את קובץ תוכנית הדופק. בשורה 179, הסר את נקודתיים הנקודה-פסיק שלפני goto 999 ושמור את הקובץ. באמצעות הפקודה GS, התאם את הפרמטרים SPDB2 כדי למזער את עוצמת אות ה- FID.
לאחר שינוי עוצמת האות, הצג מחדש את נקודתיים הנקודה-פסיק בשורה 179 של קובץ תוכנית הדופק ושמור את הקובץ. כדי למטב את PLDB2, הגדר את רווח המקלט לאחד והזן משיכה EDC כדי לפתוח את קובץ תוכנית הדופק. בשורה 184, הסר את נקודתיים הנקודה-פסיק שלפני goto 999 ושמור את הקובץ.
באמצעות הפקודה GS, התאם את הפרמטרים PLDB2 כדי למזער את עוצמת אות ה- FID. כאשר עוצמת האות שונתה, הצג מחדש את נקודתיים הנקודה-פסיק בשורה 184 של קובץ תוכנית הדופק ושמור את הקובץ. הפעל את הפקודה RGA כדי למטב את רווח המקלט.
לאחר מכן הפעל את הפקודה ZG כדי להתחיל את הניסוי. באיור זה, ניתן לראות את התוצאות של פרופילי פיזור הרפיה שנרכשו עבור כל שיא בספקטרום מימן חנקן 15 טרוסי. מפרופילי פיזור הרגיעה הנרכשים, ניתן להעריך את תרומת ההחלפה לחנקן 15 הרפיה רוחבית של כל קבוצת AMI עמוד שדרה.
על ידי התוויית הרפיה רוחבית על המבנה 3D של החלבון תחת חקירה אפשר לזהות את האזורים המבניים שעברו חילופי אישור על ציר הזמן אלפית השנייה מיקרו שניות. מידול עקומות פיזור ההרפיה באמצעות משוואות קארבר-ריצ'רדס מחזיר את הפרמטרים התרמודינמיים והקינטיים בתהליך ההחלפה, כגון אוכלוסיות השבר של המדינות בשיווי משקל ושער החליפין בין מדינות אלה. התלות בטמפרטורה של פרמטרים תרמודינמיים וקינטיים אלה יכולה להיות מעוצבת באמצעות משוואות van't Hoff ו- I-ring, בהתאמה, כדי לקבל מידע מפורט על האנרגיות של חילופי האישור.
זה חיוני כדי לייעל בזהירות את כל הפרמטרים הרכישה, במיוחד P7. חשוב גם לייצר דגימות טהורות והומוגניות מאוד, כדי למנוע פיזור מזויף. הפרמטרים הקינטיים, התרמודינמיים והכימיים שהושגו באמצעות פרוטוקול זה יכולים לשמש להפקת מידע אנרגטי ומבניות על המינים העוברים את חילופי האישורים. אפיון הדינמיקה אישור החלבון המתקבל על ידי שיטות CPMG מספק מידע חיוני להבנת איתות ופעילות אנזימטית, כמו גם פרספקטיבות חדשות לעיצוב תרופות.
