このプロトコルは、さまざまな細胞プロセスを理解するために不可欠なタンパク質立体構造ダイナミクスの検出と特性評価に使用できます。他の方法と比較して、この方法は特殊なサンプル調製ステップを必要とせず、キネティックス、熱力学、および確認平衡の構造的側面の包括的な特性を提供する。CPMG緩和分散は、核酸および他の生体分子における確認ダイナミクスの特性化や、リガンドナノ粒子相互作用の特性化のために、より広く適用することができる。
当社のプロトコルは、初めてのCPMGユーザーを対象としています。だから、それは良い出発点です。しかし、従来のNMR実験を実行するための基本的な手順をユーザーに知っ求めています。
初めて NMR 実験をセットアップするには、まずこれらの補助ファイルをダウンロードして解凍します。ビットをコピーします。vvとtrosy_15N_CPMG。
パルスプログラムフォルダ内のvvファイルをパルスプログラムディレクトリに移動します。取得ソフトウェアを開き、EDC コマンドを使用して、以前に実行した水素窒素 15 HSQC 実験を新しい実験にコピーします。パルスプログラムコマンドを使用してtrosy_15N_CPMGをロードします。
vvパルスプログラムファイルを新しく作成した実験に。次に、パルス プログラム ファイルの末尾の指示を使用して CPMG 実験をセットアップします。日常的なNMR実験を設定するには、サンプルを磁石に導入し、基本的なNMR取得手順をすべて実行します。
P1を水素硬度90度パルスの持続時間に設定し、P7を持続時間窒素15硬度90度パルスに設定する。取得ウィンドウで、水素と窒素15の寸法の中心とスペクトル幅を設定します。緩和遅延を0.7 T2に設定し、VC listコマンドを使用してNに対応する整数のリストを作成します。
L8 を VC リストのエントリ数に設定し、L3 を間接寸法の実数に設定し、1TD を L3 倍 2 倍に設定します。水の抑制を最適化するには、受信機ゲインを1に設定し、EDCプルと入力してパルスプログラムファイルを開きます。91 行目で、goto 999 の前にあるセミコロンを削除し、ファイルを保存します。
GS コマンドを使用して、FID 信号の強度を最小限に抑えるために SPDB0 パラメーターを調整します。信号強度が変更されたら、パルスプログラムファイルの91行目にセミコロンを再導入し、ファイルを保存します。SPDB11 を最適化するには、受信機ゲインを 1 に設定し、タイプ EDC プルを設定してパルス・プログラム・ファイルを開きます。
168 行目で、goto 999 の前にあるセミコロンを削除し、ファイルを保存します。GS コマンドを使用して、FID 信号の強度を最小限に抑えるために SPDB11 パラメータを調整します。信号強度が変更されたら、168行目にセミコロンを再導入し、ファイルを保存します。
SPDB2 を最適化するには、受信機ゲインを 1 に設定し、EDC プルと入力してパルス・プログラム・ファイルを開きます。179 行目で、goto 999 の前にあるセミコロンを削除し、ファイルを保存します。GS コマンドを使用して、FID 信号の強度を最小限に抑えるために SPDB2 パラメーターを調整します。
信号強度が変更されたら、パルスプログラムファイルの行179でセミコロンを再導入し、ファイルを保存します。PLDB2を最適化するには、受信機ゲインを1に設定し、EDCプルを入力してパルス・プログラム・ファイルを開きます。184 行目で、goto 999 の前にあるセミコロンを削除し、ファイルを保存します。
GS コマンドを使用して、PLDB2 パラメーターを調整して、FID 信号の強度を最小化します。信号強度が変更されたら、パルスプログラムファイルの行184でセミコロンを再導入し、ファイルを保存します。RGA コマンドを実行して、レシーバゲインを最適化します。
次に、ZG コマンドを実行して実験を開始します。この図では、水素窒素15トロシースペクトルにおけるピーク毎に取得した緩和分散プロファイルの結果が観察できる。取得した緩和分散プロファイルから、各骨格AMI基の窒素15横方向緩和への交換寄与を推定することができる。
調査中のタンパク質の3D構造に横方向の緩和をプロットすることにより、マイクロ秒ミリ秒のタイムスケールで確認交換を行っている構造領域を同定することが可能です。カーバー・リチャーズ方程式を使用した緩和分散曲線のモデリングは、平衡状態の州の小数母集団やこれらの状態間の交換速度など、交換プロセスにおける熱力学的および運動的パラメータを返します。これらの熱力学および運動パラメータの温度依存性は、van't Hoff方程式とIリング方程式をそれぞれ使用してモデル化し、確認交換のエネルギーに関する詳細な情報を得ることができます。
すべての取得パラメータ、特にP7を慎重に最適化することが重要です。また、スプリアス分散を避けるために、非常に純粋で均質なサンプルを生成することも重要です。このプロトコルを使用して得られた運動、熱力学、および化学チップパラメータは、確認交換を受けている種に関するエネルギー的かつ構造的な情報を導出するために使用することができる。CPMG法によって得られるタンパク質確認ダイナミクスの特性評価は、シグナル伝達および酵素活性の理解に向けた重要な情報と、薬物設計のための新しい視点を提供する。
