Este protocolo pode ser usado para detecção e caracterização da dinâmica conformacional proteica, que são essenciais para a compreensão de uma grande variedade de processos celulares. Em comparação com outros métodos, este método não requer etapas especializadas de preparação da amostra e fornece em caracterização abrangente da cinética, termodinâmica e aspectos estruturais do equilíbrio confirmacional. A dispersão de relaxamento do CPMG pode ser aplicada mais amplamente para a caracterização da dinâmica confirmacional em ácidos nucleicos e outras biomoléculas, bem como para a caracterização de interações de ligantes e nanopartículas.
Nosso protocolo é voltado para usuários cpmg iniciantes. Então é um bom ponto de partida. No entanto, esperamos que os usuários saibam os passos básicos para executar experimentos NMR convencionais.
Para configurar um experimento NMR pela primeira vez, primeiro baixe e descompacte esses arquivos suplementares. Copie os Bits. VV e trosy_15N_CPMG.
arquivos vv na pasta do programa de pulso para o diretório do programa de pulso. Abra o software de aquisição e use o comando EDC para copiar um experimento de nitrogênio de hidrogênio de 15 HSQC anteriormente executado em um novo experimento. Use o comando do programa de pulso para carregar o trosy_15N_CPMG.
arquivo do programa vv pulse no experimento recém-criado. Em seguida, use as instruções do final do arquivo do programa de pulso para configurar o experimento CPMG. Para configurar um experimento de NMR de rotina, introduza a amostra ao ímã e realize todas as etapas básicas de aquisição de RMN.
Coloque P1 à duração do hidrogênio com pulsos de 90 graus e P7 até a duração nitrogênio 15 pulsos duros de 90 graus. Na janela de aquisição, defina a largura central e espectral para as dimensões de hidrogênio e nitrogênio 15 dimensões. Defina o atraso de relaxamento para 0,7 T2 e use o comando da lista VC para criar uma lista de números inteiros correspondentes a N.Depois de confirmar que cada entrada na lista corresponde a um campo CPMG diferente de acordo com o CPMG arquivado igual a vezes 4N dividido por D30, verifique se o primeiro número da lista é zero.
Defina L8 para o número de entradas na lista VC, L3 para o número de pontos reais para a dimensão indireta, e 1TD para L8 vezes L3 vezes dois. Para otimizar a supressão da água, defina o ganho do receptor para um e digite o EDC puxar para abrir o arquivo do programa de pulso. Na linha 91, remova o semi-cólon anterior ao goto 999 e salve o arquivo.
Usando o comando GS, ajuste os parâmetros SPDB0 para minimizar a intensidade do sinal FID. Quando a intensidade do sinal for modificada, reintroduza um semi-cólon na linha 91 do arquivo do programa de pulso e salve o arquivo. Para otimizar o SPDB11, defina o ganho do receptor para um e o tipo EDC puxar para abrir o arquivo do programa de pulso.
Na linha 168, remova o semi-cólon anterior ao goto 999 e salve o arquivo. Usando o comando GS, ajuste os parâmetros SPDB11 para minimizar a intensidade do sinal FID. Quando a intensidade do sinal for modificada, reintroduza o semi-cólon na linha 168 e salve o arquivo.
Para otimizar o SPDB2, defina o ganho do receptor para um e digite o puxão EDC para abrir o arquivo do programa de pulso. Na linha 179, remova o semi-cólon anterior ao goto 999 e salve o arquivo. Usando o comando GS, ajuste os parâmetros SPDB2 para minimizar a intensidade do sinal FID.
Quando a intensidade do sinal tiver sido modificada, reinsira o semi-cólon na linha 179 do arquivo do programa de pulso e salve o arquivo. Para otimizar o PLDB2, defina o ganho do receptor para um e digite o puxão EDC para abrir o arquivo do programa de pulso. Na linha 184, remova o semi-cólon anterior ao goto 999 e salve o arquivo.
Usando o comando GS, ajuste os parâmetros PLDB2 para minimizar a intensidade do sinal FID. Quando a intensidade do sinal for modificada, reintroduza o semi-cólon na linha 184 do arquivo do programa de pulso e salve o arquivo. Execute o comando RGA para otimizar o ganho do receptor.
Em seguida, execute o comando ZG para iniciar o experimento. Nesta figura, os resultados dos perfis de dispersão de relaxamento adquiridos para cada pico no espectro de nitrogênio hidrogênio 15 Trosy podem ser observados. A partir dos perfis de dispersão de relaxamento adquiridos, é possível estimar a contribuição cambial para o relaxamento transversal de nitrogênio 15 de cada grupo de AMI backbone.
Ao traçar o relaxamento transverso na estrutura 3D da proteína sob investigação é possível identificar as regiões estruturais submetidas à troca de confirmação na escala de tempo de milissegundos microsegundos. A modelagem das curvas de dispersão de relaxamento utilizando as equações de Carver-Richards retorna os parâmetros termodinâmicos e cinéticos no processo de troca, como as populações fracionárias dos estados em equilíbrio e a taxa de câmbio entre esses estados. A dependência de temperatura desses parâmetros termodinâmicos e cinéticos pode então ser modelada usando as equações van't Hoff e I-ring, respectivamente, para obter informações detalhadas sobre a energia da troca de confirmação.
É fundamental otimizar cuidadosamente todos os parâmetros de aquisição, em particular p7. Também é importante produzir amostras altamente puras e homogêneas para evitar dispersões espúrias. Os parâmetros cinéticos, termodinâmicos e químicos obtidos usando este protocolo podem ser usados para obter informações energéticas e estruturais sobre as espécies submetidas à troca de confirmação. A caracterização da dinâmica de confirmação de proteínas obtida pelos métodos cpmg fornece informações cruciais para a compreensão da sinalização e da atividade enzimática, bem como novas perspectivas para o design de medicamentos.
