פרוטוקול זה מאפשר הערכה במבחנה של ההשפעה של כליאה ונוקשות בינונית שאליה נחשפים מגהקריוציטים מקומיים במח העצם על התנהגותם והבשלתם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא מודל פשוט אשר מבטל אינטראקציות תא-תא ומטריצת תאים ומתמקד בהיבטים המכניים. יש להקפיד על תרגול מעבדה טוב ותנאי עבודה סטריליים.
ואכן, אפילו זיהום קל של הידרוג'ל יכול להיות השפעה דרמטית על בידול megakaryocyte. כדי להשיג באר אחת של תרבית תאי הידרוג'ל, להתחיל על ידי הפשרת שני aliquots מיליליטר אחד של 3%methylcellulose בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לצפות מזרק מנעול לולר מיליליטר אחד עם methylcellulose על ידי משיכה תחילה מיליליטר אחד ולאחר מכן גירוש כל זה. לאחר מכן, באמצעות אותו מזרק ומחט, לצייר 333 microliters של methylcellulose מן aliquot טרי.
לאחר הסרת המחט בזהירות, השתמש במלקחיים מעוקרים כדי לדפוק מחבר מנעול Luer על קצה המזרק, ולאחר מכן חבר מזרק מנעול לולר אחד לא מצופה שני למחבר. מחלקים באותה מידה את המתילסלוז בין שני המזרקים ומניחים אותם בצד. לאחר מכן, יש לתכנת מחדש את שושלת העכברים המבודדת בעבר גזע המטופויאטי שלילי ותאי אבות במדיום התרבות המרוכז בצפיפות של פעם אחת כפול 10 עד 6 תאים לכל 167 מיקרוליטרים.
נתק את אחד המזרקים מהמחבר ואת פיפטה 167 מיקרוליטרים של מתלה התא ישירות לתוך המחבר ובו זמנית ציור בוכנה מזרק לאט כדי לפנות מקום מתלה התא. לאחר הוספת כל ההשעיה של התא לתוך המחבר, למשוך את הבוכנה עוד יותר כדי למשוך את המתלה מן המחבר בזהירות להתחבר מחדש את המזרק השני, תוך הקפדה לא לאבד כל השעיה בחוט הבורג. כדי להומוגניזציה של המדיום המתילצלולוז עם ההשעיה של התא, הזז לאט לאט את הבוכנה הלוך ושוב בין שני המזרקים 10 פעמים, ואז משוך את הנפח הכולל למזרק אחד וניתק את שני המזרקים, והותיר את המחבר על המזרק הריק.
רוקנו את תכולת המזרק לבאר אחת של צלחת ארבע בארות ודגרו את הצלחת ב-37 מעלות מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני. כדי לנתח פרופלטלטים, ביום השלישי של התרבות, בזהירות להעביר את כל התאים מבאר אחת לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של DMEM עם 1%PSG. Resuspend התאים על ידי צנרת בעדינות כדי לדלל לחלוטין את methylcellulose, ולאחר מכן צנטריפוגה הצינור במשך חמש דקות ב 300 פעמים G בטמפרטורת החדר.
לאחר השלכת supernatant, resuspend את גלולה התא במיליליטר אחד של מדיום תרבות מלאה ולזרוע מחדש את התאים ב 500 microliters לכל באר של צלחת ארבע באר. לדגור על הלוח ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. למחרת, באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד עם מטרה של 20X, לרכוש באופן אקראי 10 תמונות לבאר, הקפדה לא להיות יותר מדי תאים בשדה הראייה ולוכד לפחות חמישה megakaryocytes לכל שדה.
באמצעות ImageJ, לספור את המספר הכולל של megakaryocytes ואלה הרחבת proplatelets בכל תמונה כדי לחשב את החלק היחסי של מגהקריוציטים הרחבת פרופלטלטים. כדי לתקן את התאים עבור ניתוחים עתידיים, להוסיף את הפתרון הקיבוקטיבי על גבי methylcellulose מבלי לשבש את הג'ל. לאחר המתנה לזמן מתאים בהתאם לקיבוע המשמש, השתמש פיפטה P1000 כדי pipette בעדינות את הקיבוע ואת הג'ל עד methylcellulose כבר מדולל הומוגני.
ובאמצעות אותו קצה פיפטה, העבירו את כל תכולת הבאר לצינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של DPBS והומוגניזציה על ידי ערבוב. צנטריפוגות התערובת. להשליך את supernatant ו resuspend גלולה megakaryocyte במדיום המתאים לניתוח הרצוי.
ביום השלישי של התרבות, megakaryocytes במדיום הנוזלי יש משקעים בתחתית הבאר והם במגע עם משטח פלסטיק נוקשה, כמו גם תאים אחרים. לעומת זאת, תאים המוטמעים בהידרולג'ל מתילצלולוז מופצים באופן הומוגני ומבודדים מתאים סמוכים. ניתוח של הקוטר הממוצע של megakaryocytes בתנאי תרבות שונים מראה כי 2%methylcellulose מעט מגביר את קוטר megakaryocyte הממוצע לעומת התרבות הנוזלית.
עם זאת, הגדלת ריכוז methylcellulose על ידי 0.5% פוגע בידול megakaryocyte כפי שצוין על ידי קוטר ממוצע קטן יותר. בתמונות מיקרוסקופיות אלקטרוניות שידור מייצגות, הממברנות intracytoplasmic במגקריוציטים המובחנים ב vivo בתוך מח העצם נראה מתנגדים באופן הדוק עם שטחים ציטופלסמיים מתווים. בתרבות נוזלית, הממברנות יש בעיקר מראה אליפסה עגול קטן או שלפוחיות מוארכות ללא תיחום של שטחים ציטופלסמיים.
לעומת זאת, לתרבות המתיל צלולוז 2% יש ממברנות מנוגדות באופן הדוק עם טריטוריות ציטופלסמיות מופרדות הדומה למבנה in inu. ביום הרביעי של התרבות, megakaryocytes בעבר תרבית בהידרוגל להראות היווצרות proplatelet מוגברת לעומת אלה מתורבתים במדיום נוזלי. השיעור הממוצע של מקרוציטים הרחבת פרופלטלטים הוא בדרך כלל סביב 15 עד 20% עם טרום תרבות נוזלית לעומת 35 עד 40% עם מתילצלולוז הידרוג'ל טרום תרבות.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב pipette את הנפחים המתאימים בדיוק רב כמו שינוי מינורי בריכוז methylcellulose הסופי יכול לשנות באופן משמעותי את נוקשות התקשורת. לאחר התבגרות התא בהידרוג'ל, ניתן לשחזר מגהקריוציטים לניתוח סמן פלואידי ותא על ידי ציטומטריית זרימה או קבוע למיקרוסקופיית אלקטרונים או חיסונים של חלבון בעל עניין.
