The work was supported by grants from the Universit&#233; catholique de Louvain (Action de recherch&#233; concert&#233;es) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from T&#233;l&#233;vie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation &#224; la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).

עכברים הועלו וטופלו על פי העקרונות של טיפול בבעלי חיים במעבדה של ועדת צער בעלי החיים באוניברסיטה. כל הנהלים והפרוטוקולים אושרו על ידי ועדה זו. 1. ציפוי של מיקרוסקופית צ&#39;יימברס תרבות פלסטיק הערה: בצע את כל השלבים הבאים בתנאים סטריליים בזרימה למינרית. שני הסוגים של ציפוי הם ביצועים מקבילים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות פלסטיק מעיל עם פיברונקטין יום אחד לפני הבידוד של רקמות בלוטת התריס: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פיברונקטין סטריליים לריכוז סופי 50 מיקרוגרם / מיליליטר במדיום M199 בתוספת 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, fungizone 0.25 מיקרוגרם / מיליליטר ו -2 גלוטמין 12 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הבארות עם 200 μl של פיברונקטין המדולל ודגירת הלילה במקרר 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של הניתוח, לשאוב פיברונקטין, יש לשטוף את הבארות פעם אחת עם M199 ולהוסיף נפח מינימאלי של 200 μl של M199 בתוספת אנטיביוטיקה, גלוטמין ו10% עוברי עגל בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את התאים מצופים בחממה עד מוכן לצלחת explants. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות פלסטיק מעיל עם סוג אני קולגן 2 שעות לפני הבידוד של רקמות בלוטת התריס: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל סוג סטרילי אני קולגן לריכוז סופי 50 מיקרוגרם / מיליליטר ב10 מ&quot;מ HCl. הערה: שמור את פתרון מניות קולגן על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הבארות עם 200 μl מסוג מדולל אני קולגן ודגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הסוג קולגן אני פתרון, יש לשטוף את בארות פעם אחת עם M199 ולהוסיף נפח מינימאלי של 200 μl של M199 בתוספת אנטיביוטיקה, גלוטמין ו10% עוברי עגל בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את התאים מצופים בחממה עד מוכן לצלחת explants. </li></ol></li></ol> 2. Dissection של רקמות Anlagen המכילות בלוטת התריס (E12.5) או בלוטת התריס אונות (E13.5-E14.5) הערה: השתמש בכלים לנתח נקיים וצלחות פטרי / תרבות. הצעדים הכלליים והחתכים מפורטים להלן זהים עבור E12.5 וE14.5 עובר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב מתוזמן בהריון נקבות עכברים בעובריים הרצוי היום (ה) (מE12.5 לE14.5) ולהסיר את הרחם באמצעות מכשירים לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרחם גזור בצלחת 10 סנטימטר המכילה HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הגפיים אחת של הרחם עם מלקחיים ולפתוח את הרחם עם מספריים קטנים כדי לשחרר בהדרגה את כל העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את העוברים מהשליה במספריים ולהעביר את העוברים עם ממברנות extraembryonic בצלחת 10 סנטימטר חדש המכילה HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שק החלמון וamnion. הערה: מנקודה זו, לעבוד תחת סטראו עם שקוף מלמטה; הגדלת הגדלה בצעדים לנתיחה. משתמש במחטי טונגסטן בנימי זכוכית כמו לנתח כלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחטים כמוסכין ומזלג, להסיר את החלק העליון של הראש, כוללים הלסת העליונה והאוזניים (איור 1 א, לחתוך לאורך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את העובר על הגב שלה ולהסיר ראשון חתיכה נוספת של הצינור העצבי (איור 1 א, לחתוך לאורך ב), ולאחר מכן את החלק התחתון של העובר, ממש מתחת לגפיים הקדמי ומעל ללב (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את פרוסת העובר המכילה את הלשון (כדי לכוון את הרקמה) ואזור צוואר בצלחת 10 סנטימטר חדש המכילה HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור העצבי ורקמות אחוריות לושט / קנה הנשימה (איור 1 ג, לחתוך לאורך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות סעיף פרוסת הרקמה לאורך שני הצדדים של הלשון (איור 1 ג, לחתוך לאורך B ו-B &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את הוושט ואת קנה הנשימה, בהארכה של הלשון, ולנתח משם את הלשון, שעזב את arytenoid נפיחות (1D איור, לחתוך לאורך), והרקמות בבוטצדדים שעות של הוושט / קנה הנשימה (איור 1D, לחתוך לאורך B ו-B &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הוושט, ולמקם את קנה הנשימה עם צד הגחון שלה פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שם לנתח רקמות לא רצויות כמו התימוס (איור 1E) וכל הרקמות ממוקמות רוחבי לעורקי קשת בלוע. לE13.5 או E14.5 עובר, לדמיין את אונות בלוטת התריס בכל צד של קנה הנשימה (איור 1F; קווים מקווקווים אדומים) ולנתח עוד יותר את האונות מקנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את האזור המבודד קנה הנשימה E12.5, או אונות בלוטת התריס E13.5-E14.5 לתוך צלחת תרבות 35 מ&quot;מ המכילה בינוני M199 מחומם מראש בתוספת אנטיביוטיקה, גלוטמין ו10% עוברי עגל בסרום. העבר את explants באמצעות קצה מסנן prewetted על micropipette P-200. לexplants E12.5, לחתוך את הקצה של הקצה כדי להרחיב את הפתח. הערה: באופן שגרתי, ואם יש עוברים גנוטיפ זהה, לבצע שלבים 6 ו -7 על כל העוברים,n 9-11, ולבסוף 12 &amp; 13. </li></ol> 3. ציפוי ותרבות של Explants בלוטת התריס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את explants ידי העברה רצופה בשלוש בארות של צלחת 24 גם מכילה 1 מיליליטר של מדיום התרבות מחומם מראש (= M199 בתוספת אנטיביוטיקה, גלוטמין ו10% עוברי עגל בסרום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי של אונות בלוטת התריס על תאי תרבות מצופים פלסטיק מיקרוסקופית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיום התרבות לשאוב M199 מהתאים המצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות, להעביר את explants בלוטת התריס לתאי התרבות באמצעות טיפים micropipette ומסנן. הנח explant אחד במרכזו של כל תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני עודף ולמקם את חדר התרבות בתרבית רקמת חממה (37 C °; CO 2 של 5%) עבור שעה 2 לתת explants לצרף למטריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 200-300 μl של מדיום התרבות מחומם מראש היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לתרבות לטווח ארוך בחממה בתרבית הרקמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי oאונות אזור קנה הנשימה ו או בלוטת התריס על מסנני semiporous: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את מספר הבארות של צלחת 24 גם נדרשה עם 330 μl של מדיום התרבות מחומם מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנני מקום (למשל 0.4 מיקרומטר סינון Millipore) על המדיום, לטפל כדי למנוע לכידה של בועות אוויר מתחת למסנן התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות, תוך שימוש בטיפי micropipette ולסנן, להעביר את explants בלוטת התריס עם נפח מינימאלי של מדיום על גבי במרכז המסננים (4/filter המרבי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את העודפים של מדיום ומתוך חלל explants עם מחט טונגסטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לתרבות לטווח ארוך בחממה בתרבית הרקמה. הערה: מדיום תרבות שינוי בכל יום אחר תחת הזרימה למינרית. תרבות explants עד 7 ימים. </li></ol></li></ol> 4. כל הר Immunofluorescence מכתימים פרוטוקול Explants בלוטת התריס לעקור explants גדל על מסננים (אחרי שלב 2 להלן) באמצעות מחטים או טונגסטןמלקחיים בסדר והעברה בצלחת 24 גם לכל השלבים, פרט לincubations ראשוני (שלב 5) והמשני (שלב 7) נוגדן (צלחת 96 היטב). לexplants חסיד תרבית על תאי פלסטיק מיקרוסקופית, לבצע את כל השלבים בתאי התרבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בינוני M199 התרבות ולתקן את explant עם paraformaldehyde 4% קרים כקרח (PFA) עבור 20 דקות (500 μl בצלחת 24 גם ו300 μl בשקופיות מיקרוסקופ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2x 10 דקות בטריס שנאגרו מלוח עם טריטון (TBST; 50 מ&quot;מ טריס HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0,1% טריטון X-100) ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את explants מייד או לאחסן ב -20 ° C. הערה: לאחסון לטווח ארוך ב -20 ° C, מייבשים את explants במתנול על ידי הגדלת בהדרגה ריכוז מתנול ב TBST להגיע מתנול 100%. כאשר מוכן להמשיך עם immunostaining (שלב 4), רעננות explants ידי הוספת TBST הדרגה למתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף TBST עם פתרון החסימה (10% עיזים סרום נורמלי בTBST) ו לדגור על כיסא נדנדה ים ראה ל30-60 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נוגדן ראשוני בחסימת פתרון (100-200 μl לכל מצב). העבר את explants &quot;לסנן&quot; מצלחת 24 גם לצלחת 96 היטב. דגירה explants עם הנוגדנים הראשוניים על כיסא נדנדה ים ראה לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לבטל את פתרון הנוגדן הראשוני, להעביר את explants &quot;המסנן&quot; חזרה בצלחת 24 גם, ולשטוף לפחות חמש פעמים עם TBST על כיסא נדנדה ים ראה ל45-60 דקות כל אחד ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל נוגדנים משני (למשל אנטי-X-Alexa פלואוריד עיזים ב1:2,000 דילול) ב TBST המכיל 1% מעזים בסרום נורמלי ודגירת explants עם דילול זה לילה על כיסא נדנדה ים נדנדה על 4 מעלות צלזיוס ובחושך. לcounterstaining הגרעיני, כולל 1 מיקרוגרם / מיליליטר של bis-Benzimide (Hoechst) יחד עם פתרון נוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לבטל את פתרון נוגדנים משני ולשטוף 5x עם TBST על ים ראהנדנדה ל45-60 דקות כל אחד ב RT. במהלך שוטף, לשמור explants בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שטיפה נוספת בTBST עדינות מתערבל הלילה ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Postfix explants immunostained PFA 4% ב 4 ° C למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2x 10 דקות עם TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את explants או במתנול בהדרגה 100% עבור אחסון לטווח ארוך ב -20 מעלות צלזיוס, או לנתח באופן מיידי. לexplants תרבית על מסננים, וimmunostained בצלחת 24 גם, העברה בתא מיקרוסקופית (למשל LabTek או Ibidi) עם TBST או בינוני הרכבה ניאון טוב יותר לפני ניתוח עם multiphoton או מיקרוסקופ confocal. </li></ol> 5. הפקת RNA מבלוטת התריס לעבוד בסביבה נטול RNase. לכן, שימוש בחומצות גרעין וטיפים פיפטה nuclease חופשי ולנקות גם ספסל וציוד מהמזהמים וRNases. פרוטוקול זה שמבוסס על פנול / כלורופורם, לבצע את הצעד הראשוןים (1 עד 7) מתחת למכסת מנוע כימי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize explant בלוטת התריס אחד או שתי אונות של בלוטת התריס עם 300 μl של פתרון מיצוי RNA באמצעות העלי חד פעמי עבור 1.5 צינור מיליליטר. בין דגימות, לשטוף את העלי ב2% SDS, ולאחר מכן במים, ולאחר מכן אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של פתרון מיצוי RNA עוד 100 μl, מערבולת 10 שניות ולדגור על RT עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ורטקס למשך 30 שניות ולהוסיף 20 ng של tRNA לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת דקות 1 ולהוסיף 80 μl של כלורופורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס במרץ ל30 שניות והדגירה 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ל15 דקות ב 19,000 XG בצנטריפוגה בקירור (4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר בזהירות את השלב המימית העליון חסר הצבע בצינור טרי המכיל 20 מיקרוגרם של גליקוגן כcoprecipitant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ורטקס ולהוסיף 200 μl של 100% אלכוהול isopropanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס במרץ ל15-30 שניות ולתת משקע RNA ב-20 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שעות או ב-C ° -80 במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ל30 דקות ב 19,000XG ב 4 ° C, ולחסל את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור עם 450 μl אתנול 75% קרים ומערבולת כדי לסלק את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין 10 דקות ב 19,000 XG ב 4 ° C, ולחסל את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את הכדור מתחת למכסת המנוע למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור עם 10 μl מים RNase ללא דגירה 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוז assay RNA, חנות ב -80 מעלות צלזיוס או להפוך לתמלל עבור ניתוח ביטוי גנים. </li></ol>

<ol>
	<li>Colin, I. M., Denef, J. -. F., Lengel&#233;, B., Many, M. -. C., G&#233;rard, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+the+cell+biology+of+thyroid+angiofollicular+units.">Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units.</a> Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).</li><li>Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+mouse+thyroid+embryonic+vessel+contacts+and+parenchymal+growth+pattern+during+specification+budding,+migration,+and+lobulation.">The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation.</a> Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).</li><li>Fagman, H., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+thyroid+gland.">Morphogenesis of the thyroid gland.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).</li><li>Fagman, H., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetics+of+early+thyroid+development.">Morphogenetics of early thyroid development.</a> J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).</li><li>De Felice, M., Di Lauro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+development+and+its+disorders+genetics+and+molecular+mechanisms.">Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms.</a> Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).</li><li>De Felice, M., Di Lauro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+factors+in+thyroid+gland+development:+an+update.">Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update.</a> Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).</li><li>Hick, A. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+epithelial+paracrine+interactions+during+thyroid+development+govern+follicular+organization+and+C-cells+differentiation.">Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation.</a> Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).</li><li>Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+integration+of+thyrocytes+and+thyroid+folliculogenesis:+a+perspective+for+thyroid+tissue+regeneration+and+engineering.">Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering.</a> Endocr. J. 48, 407-425 (2001).</li><li>Toda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+models+for+studying+thyroid+biology+and+disorders.">Culture models for studying thyroid biology and disorders.</a> ISRN Endocrinol. , (2011).</li><li>Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+factors+regulating+growth+and+function+of+human+thyroid+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo.</a> 213, 47-58 (2003).</li><li>Antonica, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+thyroid+from+embryonic+stem+cells.">Generation of functional thyroid from embryonic stem cells.</a> Nature. 491, 66-71 (2012).</li><li>van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh-dependent+differentiation+of+intestinal+tissue+from+embryonic+pancreas+by+activin+A.">Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A.</a> J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).</li><li>Hick, A. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands:+a+role+for+SDF-1.">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9. , (2009).</li><li>Pierreux, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial:Endothelial+cross-talk+regulates+exocrine+differentiation+in+developing+pancreas.">Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas.</a> Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging.">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li><li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+ex-vivo+culturing+of+embryonic+pancreas.">A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Watanabe, T., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+ureteric+bud+branching+morphogenesis+in+vitro.">Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro.</a> Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מאמר זה מתאר שיטה לניתוח, culturing explants בלוטת התריס (E12.5) או אונות (E14.5) על מנת ללמוד ולהבין טוב יותר את האירועים המורכבים שמוביל להיווצרות של בלוטת התריס. בשל המוצא הכפול של anlagen בלוטת התריס (anlage קו האמצע ושני הגופים ultimobranchial לרוחב), והגודל הקטן שלהם, שבר של מקורי מקומי רקמת E...

בלוטת התריס היא אוסף של תחומים אפיתל עצמאיים, המכונה זקיקים, מוקף רשת צפופה של נימי דם אנדותל. ארגון זה מאפשר תפקוד בלוטת התריס: נימי אנדותל לספק thyrocytes עם יוד, הנדרש לסינתזת הורמון T3 ו-T4, ולהפיץ את אלה האחרונים לכל הגוף. מפוזר בין הזקיקים ונימי הדם, C-תאים לייצר את הורמון hypocalcemic calcitonin 1. למרות שהארכיטקטורה של בלוטת התריס למבוגרים ופונקציות ידועות, המנגנונים התאיים ומולקולריים המעורבים בהתפתחות בלוטת התריס עוברית (היווצרות זקיק ובידול) הם רחוקים מלהיות מובן. במהלך עובר, thyrocytes אב מקורו כעיבוי (anlage קו האמצע) של קיר הגחון של האנדודרם המעי הקדמי ביום עוברי (ה) 8.5 בעובר של העכבר, ואילו אבות C-תאים שמקורם בE11.5 כבליטות דמוי טיפה ( bo ultimobranchialמת) של שקיות בלוע הרביעית 2-6. ניצן קו האמצע ואז מתנתק מהאנדודרם, מרחיב בילטרלי הפתיל בE13.5 עם גופי ultimobranchial בכל צד של קנה הנשימה. לבסוף, thyrocytes לארגן לתוך זקיקים ו-C-תאים להתמיין. ידע הנוכחי על היווצרות בלוטת התריס בעיקר מגיע מניתוח היסטולוגית של רקמות קבועות, אבל אירועי morphogenetic המעורבים בהיווצרות בלוטת התריס הם דינמיים מאוד וכרוכים בתקשורת ויחסי גומלין בין תאים מסוגים שונים ועם מטריקס. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי אבות thyrocyte לייצר רמות גבוהות של VEGF לגייס תאי האנדותל לבלוטת התריס מתפתח, ו, בתורו, גייסו את תאי האנדותל לקדם היווצרות זקיק והתמיינות תאי C-7. רוב מחקרי vivo לשעבר בבלוטת התריס בוצעו על תאי שמקורם בבלוטת תריס למבוגרים מבודדים, גדלו גם על ד פלסטיק תרבית רקמת 2Dishes או במטריצות 3D. שימוש בסוגים אלה של תרבויות, תאי זקיקי הבדיל או יישארו מקוטב ומאורגן כמו זקיקים או לרכוש מחדש ארגון 3D 8-10. עם זאת, תאים אלו טהורים אפיתל, explanted מהסביבה הפיזיולוגית שלהם, ותרבותיים ב2D, להתעלם מאינטראקציות עם מטריצה ​​תאית, ציטוקינים, גורמי גדילה ועם סוגי תאים אחרים, כמו תאי האנדותל או עצבים שהם בדרך כלל נתקלים בגוף חי. מחקר נחמד מאוד לאחרונה תאר פרוטוקול התמיינות של תאי גזע עובריים לזקיקי בלוטת התריס באמצעות צעד תרבות סופי בmatrigel 3D 11. עם זאת, תרבויות 3D אלה חוסר מגע עם סוגי תאים אחרים. בהתבסס על המומחיות קודמת בלבלב ובלוטות רוק תרבות איבר 12-14, שיטה לנתח anlagen בלוטת התריס העוברי של העכברים וculturing explants על מסנני semiporous או בשקופיות פלסטיק מיקרוסקופית פותחה. כאשרעבודה עם עוברי E12.5, המקור הכפול של anlagen בלוטת התריס (anlage קו האמצע ושני גופי ultimobranchial לרוחב) שהוטל microdissection של שבר גדול של רקמה. זה הכיל את קנה הנשימה, אבל לא את הוושט, והוארך מעורקי קשת בלוע עד נפיחות arytenoid. כאשר בתרבית על מסננים, anlage קו האמצע משתרע רוחבי בכל צד של קנה הנשימה, שבו הם מתמזגים עם גופי ultimobranchial כדי ליצור את אונות בלוטת התריס שתיים, עדיין מחוברים על ידי מצר צר. בתרבות, בתאי אפיתל להתרבות, לארגן לזקיקים ולהתמיין לthyrocytes ו-C-תאים, תלוי במוצא שלהם. תאי האנדותל המופיעים ברקמות microdissected גם להתרבות ולפלוש לאונות בלוטת התריס סוף סוף לקשר הדוק עם מבנה זקיקי אפיתל, ללא תלות בזרימת דם או גורמים במחזור. כמו פיתוח של explants בנאמנות משחזר in vivo לפתחment, מערכת זו התרבות היא אופטימלי ללמוד morphogenetic ואירועי בידול המתרחשים במהלך התפתחות בלוטת התריס. ניתן להשיג רקמות בלוטת התריס מסוג בר, נוקאאוט או עוברים מהונדסים ניאון, ומערכת התרבות ניתנת להורדה ובניסויי רווח של הפונקציה. לבסוף, הזמן לשגות הדמיה של explants בלוטת התריס שכותרתו fluorescently על צלחות פלסטיק מיקרוסקופית ניתן לנצל כדי לחקור טוב יותר קינטיקה והמשכיות של תנועות morphogenetic המתרחשות בגוף חי. זמן לשגות הדמיה כבר נעשתה שימוש כדי ללמוד המורפוגנזה הסתעפות של הלבלב 15,16 או ניצן ureteric 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">&#181;-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile</td>
			<td style="width:85px;">proxylab</td>
			<td style="width:119px;">80826</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen Type I, rat tail</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td># 33010-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">M199</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">HBSS</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>14025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Tungsten wire</td>
			<td style="width:85px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:119px;">LS237450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">culture plate insert (12 mm diameter)</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">E-cadherin</td>
			<td style="width:85px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610182</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Ezrin</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MS-661-P1</td>
			<td>1/400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">PECAM</td>
			<td style="width:85px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">550274</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Hoechst</td>
			<td style="width:85px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo culture system to study thyroid development

בלוטת התריס היא בלוטה האנדוקרינית bilobated המקומית בבסיס הצוואר, ייצור הורמוני בלוטת התריס T3, T4, וקלציטונין. T3 ו-T4 מיוצרים על ידי thyrocytes המובחן, שאורגן בתחומים סגורים הנקראים זקיקים, בעוד קלציטונין הוא מסונתז על ידי C-תאים, וביניהם בין הזקיקים ורשת צפופה של נימי דם. למרות שארכיטקטורה של בלוטת התריס למבוגרים ופונקציות כבר מתוארים בהרחבה ולמדו, היווצרות של היחידות &quot;Angio-פוליקולרית&quot;, ההפצה של C-תאים בparenchyma והתקשורת אוטוקריני בין האפיתל ותאי האנדותל היא רחוק מלהיות מובן. שיטה זו מתארת ​​את השלבים רציפים של נתיחת עכבר בלוטת התריס עוברית anlagen ותרבותה על מסנני semiporous או בשקופיות פלסטיק מיקרוסקופית. בתוך פרק זמן של ארבעה ימים, מערכת זו התרבות בנאמנות משחזרת בהתפתחות בלוטת התריס vivo. ואכן, מיליארדים (i)obation של האיבר מתרחש (לexplants E12.5), (ii) thyrocytes מבשרים לארגן לתוך זקיקים ולקטב, (iii) thyrocytes ו-C-תאים להבדיל, וכן (iv) בתאי האנדותל הנמצאים ברקמה להתרבות microdissected, נודדים לתוך אונות של בלוטת התריס, ושיתוף הפעולה הדוק לקשר עם תאי אפיתל, כפי שהם עושים בגוף חי. ניתן להשיג רקמות בלוטת התריס מסוג בר, נוקאאוט או עוברים מהונדסים ניאון. יתר על כן, explants תרבות ניתן להשפיע על ידי תוספת של מעכבים, חסימת נוגדנים, גורמי גדילה, או אפילו תאים או בינוניים מותנה. Ex vivo פיתוח ניתן לנתח בזמן אמת, או בכל עת של התרבות על ידי immunostaining וRT-qPCR. לסיכום, התרבות explant בלוטת התריס בשילוב עם כל הר במורד הזרם או בפרופילי הדמיה סעיפים וביטוי גנים מספק מערכת רבת עוצמה עבור מניפולציה ולומד אירועי morphogenetic ובידול של o בלוטת התריסrganogenesis.

anlages בלוטת התריס (קו האמצע וUB, יחד עם רקמות הסובבות), ואונות של בלוטת התריס הם גזורים מעוברי עכברים בE12.5 וe13.5/e14.5, בהתאמה (איור 1). לאחר יום אחד בתרבות במסנן, anlage קו האמצע הוא גלוי (איור 2 א) כרקמה מוארכת המשתרעת על גבי קנה הנשימה. זה בהדרגה יוצר שתי אונות בכ...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development at JoVE.com

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; מערכת תרבות ללמוד התפתחות בלוטת התריס

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

an-ex-vivo-culture-system-to-study-thyroid-development

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

11.4K Views.  Université catholique de Louvain & de Duve Institute. This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Video: An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

מערכת סגורה Cell תרבות פרוטוקול באמצעות כלי HYPERStack עם טכנולוגיה חומר חדיר גז

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

רומן<em&gt; Ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר Cell-Cell

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

הקמת מערכת התרבות pH חומצי חוץ-תאית

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique tissue important for proper function of the synovial joint and is constituted by a dense extracellular matrix (ECM), rich in proteoglycan and type II collagen. Chondrocytes are the only cell type present within cartilage and are widespread and relatively low in number. Altered external stimuli and cellular signalling can lead to changes in ECM composition and deterioration, which are important pathological hallmarks in diseases such as osteoarthritis (OA) and rheumatoid arthritis.
Ex vivo cartilage models allow 1) profiling of chondrocyte mediated alterations of cartilage tissue turnover, 2) visualizing the cartilage ECM composition, and 3) chondrocyte rearrangement directly in the tissue. Profiling these alterations in response to stimuli or treatments are of high importance in various aspects of cartilage biology, and complement in vitro experiments in isolated chondrocytes, or more complex models in live animals where experimental conditions are more difficult to control.
Cartilage explants present a translational and easily accessible method for assessing tissue remodeling in the cartilage ECM in controllable settings. Here, we describe a protocol for isolating and culturing live bovine cartilage explants. The method uses tissue from the bovine knee, which is easily accessible from the local butchery. Both explants and conditioned culture medium can be analyzed to investigate tissue turnover, ECM composition, and chondrocyte function, thus profiling ECM modulation.

Here, we present a protocol describing isolation and culturing of cartilage explants from bovine knees. This method provides an easy and accessible tool to describe tissue changes in response to biological stimuli or novel therapeutics targeting the joint.

Vivo לשעבר התרבות רקמה מודל של שיפוץ הסחוס של הברך שור בעלי מפעלים

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...