פרוטוקול זה מציע שיטה פשוטה להשגת אבות hematopoietic אנושי, ועל גרימת הבידול שלהם לתוך megakaryocytes. זה יכול לשמש בסיס להבנה טובה יותר של megakaryopoiesis טכניקה זו משתמשת במקור, אבל מציעה את היתרון של להיות זול ושופע למחקר מעבדה hematopoiesis. שיטה זו משמשת כדי להבין טוב יותר megakaryopoiesis עבור התא לשמש בטיפול הם יצטרכו להיות מוכנים בתנאי GMP, וזה כרגע לא המקרה.
הבנת השלבים כולל אוסף PBMC יכולה להסתיים במלואה רק עם הדגמה חזותית. לפני תחילת ניסוי, חבר מסנן לויקורדוקציה לתיק העברה ריק של 600 מיליליטר ולסט צינורות. בארון בטיחות ביולוגי להזריק 25 מיליליטר של חיץ elution מסונן לכל מסנן לויקורדוקציה לתוך השקית הריקה, ולהשתמש מזרק 30 מיליליטר כדי לשאוף בעדינות את תוכן השקית דרך המסנן.
העבר את תאי הדם האדומים שנאספו לתוך צינור חדש 50 מיליליטר, לדלל את ההשעיה התא על ידי חצי עם 2%dextran. מערבבים היטב כדי לצבור את תאי הדם ולאפשר לתאים משקעים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. כאשר תאי הדם האדומים התיישבו להעביר את supernatant לצינור 50 מיליליטר ולמלא את הצינור עם פתרון PBS EDTA שני מילימולרי.
לכסות בעדינות מחצית supernatant על 25 מיליליטר של צפיפות הדרגתי מדיום בכל אחד משני צינורות 50 מיליליטר מבלי להפריע משטח הדרגתי ולהפריד את התאים על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות. השתמש פיפטה חד פעמית כדי להעביר את התאים מכל ממשק לצינור חדש 50 מיליליטר. לשטוף את התאים פעמיים ב 50 מיליליטר של שני מילימילימטרים PBS EDTA לכל לשטוף.
לאחר הכביסה השנייה, resuspend הכדורים בנפח יחיד 50 מיליליטר של PBS EDTA טרי לספירה. כאן ניתן לעצור את ההליך על ידי שמירה על התאים שנאספו תחת עצבנות בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה. עבור בחירת CD34+תאים, קבע את מספר התא ואסוף את התאים על ידי צנטריפוגה וקבע מחדש את גלולה התא ב- 300 מיקרוליטרים של PBS EDTA של שני מילימטרים לכל 10 לתאים השמיניים.
הוסף את הנפח המתאים של קולטן FC חוסם ריאגנט ו 50 microliters של CD34 מיקרו חרוזים לכל 10 לתאים השמיניים. לאחר 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, לשטוף את התאים עם שני מילי PBS EDTA, ולתכנת מחדש את הכדור ב 500 microliters של PBS EDTA טרי שני מילימולר, לכל 10 עד שמונה תאים. לחות וגודלו המתאים של עמוד מגנטי באמצעות PBS EDTA ולאחר מכן הוסף את הדוגמה לעמודה.
לשטוף את העמודה פעמיים עם שלושה מיליליטר של שני מילימיליטר PBS EDTA לכל לשטוף. לפני התחמקות CD34 + תאים, עם שני נפחים חמישה מיליליטר של שני מילימילילר PBS EDTA לכל elution. כדי להעריך את טוהר התאים הנבחרים של החרוז המגנטי, הוסיפו שני מיקרוליטרים של נוגדן אנטי CD34 אנושי מתאים ל-100 מיקרוליטרים של התאים המבודדים וערבבו הרבה לפני הדגירה במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, לשטוף את התאים PBS ו resuspend הכדור ב 200 microliters של PBS לניתוח של טוהר דגימת התא על ידי cytometry זרימה. לאחר הספירה, לאסוף את CD34 + תאים על ידי centrifugation ומיד resuspend הכדור בתמיסה קרה אחד לצפיפות של 10 עד 6 תאים למיליליטר לפני הוספת במהירות את השעיית התא לפתרון קר שני. ואז מיד למקם את צינור ההקפאה במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות לפני העברת צינור ההקפאה לאחסון חנקן נוזלי.
במחקר מייצג זה, התאים נמצאו על ידי סינון לויקורדוקציה כפי שהוכח עם כ 95%, כדאיות. לאחר בחירת חרוזים מגנטיים, הושגה אוכלוסיית CD34+תאים טהורה יותר מ- 90%. התפשטות התאים בדרך כלל פוחתת לאחר שבוע של תרבות, אך ללא שינויים משמעותיים בכדאיות התא.
ביום השביעי, CD34 + תאים צריכים להתחיל להביע CD41, סמן ספציפי ומוקדם או עבור פיתוח megakaryocyte ו טסיות דם. ביום 10, רוב התאים בתרבות מתפתחים בדרך כלל ל- CD41 בוגר המבטא מגהקריוציטים. ביום 13, הרחבת טסיות דם pro megakaryocyte ושחרור טסיות ניתן לראות על ידי מיקרוסקופיה קלה.
המספר הכולל של CD41, CD42, 8 טסיות דם חיוביות שפורסמו לתרבות ניתן לכמת לאחר מכן באמצעות מספר מכויל של חרוזים פלואורסצנטיים. שיטה זו סוללת את הדרך לשיפור המנגנונים הבסיסיים של megakaryopoiesis ולהגדלת התשואות טסיות הדם חזותי. גם אם שיטה זו נראית מייגע, זה פשוט מאוד אתה רק צריך להיות סבלני ולהכין את כל האזורים מראש.
למרות החששות הקריטיים שלנו megakaryopoiesis אנו מקבלים תאי CD42 ניתן להשתמש מעל מסלולים hematopoietic.
