עבודה זו נתמכה על ידי SFB688 פתוח דויטשה (ל א).

העכבר הרבייה אושרה על-ידי Regierung Unterfranken ולאחר כל הבדיקות בוצעו בהתאמה קפדנית עם האיחוד האירופי וגרמנית כל החוקים והתקנות החלים לגבי טיפול ושימוש של חיות מעבדה.
1. ציפוי של Microtiter צלחות עם אינטגרין α4β1 לתרבות Explant של הרחם לשעבר Allantois
<ol><li>לשקם את אינטגרין α4β1 מאתר lyophilized-µg/mL 200 בתוך סטרילי באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). לדלל את ריכוז הסופי של µg/mL 10 ב ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) PBS. פיפטה 20 µL/טוב של הפתרון אינטגרין α4β1 מדולל לתוך המספר הנדרש של בארות של צלחת microtiter (1 allantois טוב). הערה: למנוע את היווצרות בועות אוויר בעת ציפוי הבארות של צלחת microtiter.</li>
	<li>דגירה הלוחות microtiter עבור 60 דקות ב 37 ° C על-ידי הצבתם חממה תרביות רקמה humidified.</li>
	<li>בזהירות וארוקן את תגובת שיקוע עם פיפטה. השתמש יניקה עדינה, שיפוע הבסיס כדי להימנע מלגעת התחתון טוב עם קצה פיפטה. לשטוף בארות פעמיים על-ידי הוספת µL 50 ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) תרבות בינוני כמו של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM), ולהסיר את המדיום כביסה בשאיבה עדינה.</li>
	<li>שלב קריטי: בלוק ללא תשלום מחייב אתרים על-ידי הוספת µL 50/טוב של 0.1% (w/v) אלבומין שור (BSA) / DMEM דגירה עבור ≥ 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על ידי הצבת הלוחות microtiter חממה תרביות רקמה humidified. הערה: Allantois explants יכול לצרף משטחים שונים בנוכחות סרום. לכן חיוני כדי לחסום אתרי קישור שאינם ספציפיים, לאחר ציפוי הבארות עם אינטגרין, לפני הוספת את allantois גזור עבור explant תרבות סרום המכיל בינוני (ראה שלב 4.4).</li>
	<li>שמור הבארות מצופה הפתרון חסימה ב 37 ° C עד הצורך בשלב 4.4.</li>
</ol>2. הרחם דיסקציה של עכבר בהריון-Dpc 8
הערה: להפחית את שיעורי ההריון חיובי-false לפי משקל-רווח-אפליה-15.
<ol><li>להקריב את העכבר על-ידי נקע בצוואר הרחם. לחטא את המעיל באזור הבטן על ידי התזה עם אתנול 70% (v/v). הערה: ללבוש כפפות בעת טיפול עכברים. המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם ללא הרדמה מונע זיהום כימי של allantois, אשר עלולים להפריע allantois המצורף.</li>
	<li>פתח בעור בטן על ידי ביצוע חתך קטן בקו האמצע עם מספריים. להשתמש האצבעות בכפפה כדי להחזיק את העור מעל ומתחת החתך, להפריד את העור לכיוון החזה ועל הזנב של העכבר.</li>
	<li>לתפוס את הצפק עם מלקחיים. עם היד השנייה, לעשות חתך בצורת V מ קדמי לכיוון ישבנה באמצעות מספריים, והזז את הרקמה כדי לחשוף את חלל הבטן. השתמש המלקחיים לדחוף את המעיים לצד אחד על מנת לקבל גישה אל הרחם.</li>
	<li>אתר כששתי הקרניים הרחם. להחזיק את צוואר הרחם (מקטע סימטרית) עם מלקחיים וחותכים את הרצועות עם מספריים משובחים. ואז ניתוק שתי קרניים הרחם באמצעות ניתוק של oviducts עם מספריים.</li>
	<li>להשתמש מלקחיים כדי להעביר את הרחם לתוך צלחת סטרילי 10 ס מ המכיל סטרילי, PBS בטמפרטורת החדר (RT). להסיר את רקמת שומן, כלי הדם והעצבים המקיפים את הקרניים הרחם עם מלקחיים בסדר ו/או מספריים (איור 1 א').</li>
</ol>3. העובר לנתיחה
הערה: בצע את השלבים הבאים תחת stereomicroscope מאובזר עם טווח זום 8:1.
<ol><li>הפרד את העוברים על ידי חיתוך בין האתרים השרשה עם מספריים. רירית הרחם שרירים של בלוטות הרחם עם מלקחיים ומשוך בנפרד כדי לחשוף את רותמי (איור 1B).</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, להעביר את בלוטות הרחם לתוך תבשיל 10 ס מ חדש המכיל סטרילי, RT PBS.</li>
	<li>לתקן את רותמי סביב העובר עם קצות המלקחיים.</li>
	<li>אעשה חתך בצד anti-mesometrial של רותמי עם מלקחיים בסדר (איור 1C), לקלף את רותמי עם מלקחיים לחשוף את העובר (איור 1D). הערה: mesometrial בציצית רותמי הוא מאוד vascularized והוא יכול להיות רחב בבסיסו יותר החלק anti-mesometrial, אשר מכיל את העובר ומופיע חיוורת.</li>
	<li>לנתח את העובר עם מלקחיים (איור 1E, F).</li>
	<li>באמצעות מיקרו-כף, להעביר את העובר לתוך טיפה של PBS סטרילי הכלול תבשיל סטרילי 3.5 ס"מ.</li>
	<li>להעביר את העובר לתוך טיפת PBS ב- 3.5 ס"מ את אותה המנה באמצעות מיקרו-כף טרי, לנתח את העובר של שק החלמון באמצעות מלקחיים (איור 1 ג'י, H).</li>
	<li>לחלופין, אם יש צורך (למשל, עבור genotyping על ידי תגובת שרשרת של פולימראז), להעביר שק החלמון לתוך צינור סטרילי על ידי כ רפה בעברית עם ~ 5 PBS µL לתוך טיפ גדול דיזה 200 µL פיפטה. חנות ב-20 ° C. הערה: רקמת אימהי (קרי, שק החלמון הקודקוד כולל הממברנה של רייכהרט והחרוט ectoplacental) עשויים לזהם את ההכנה שק החלמון עשוי להוביל לתוצאות genotyping מוטעים. הסרת רקמות אלו הוא הקל ביותר לפני הקרע העובר מן שק החלמון.</li>
</ol>4. allantois לנתיחה והתרבות לשעבר עם רחם על קיבוע α4β1 אינטגרין
<ol><li>חותכים את allantois מאתר הבזליים ההכנסה שלו בקצה האחורי של העובר באמצעות מלקחיים בסדר (איור 1 H).</li>
	<li>לחלופין, אם נדרשת היערכות התפתחותית, לספור זוגות somite של העובר על ידי בדיקה חזותית באמצעות מיקרוסקופ מצויד אופטיקה חדות שלב ו 5 × ויעד × 10. הערה: ניתן להרחיב את העובר עם מלקחיים כדי להקל על ספירת somite. קובץ מצורף chorioallantoic ופיוז'ן להתרחש בין E 9.0 E 8.0 העוברים עם ≥ 6 somite זוגות. המפנה מתחיל העוברים עם 6-8 somite זוגות.</li>
	<li>פיפטה 40 µL/טוב של DMEM בתוספת 10% (v/v) בסרום שור עוברית-גלוטמין, אנטיביוטיקה על המספר הנדרש של microtiter מצופים מראש צלחת וולס (ראה סעיף 1).</li>
	<li>לאסוף את allantois צפים על ידי כ רפה בעברית עם ~ 5 PBS µL לתוך דיזה גדול של קצה פיפטה 200 µL. העברת allantois 1/טוב.</li>
	<li>דגירה של allantoides על ידי הצבת הלוחות microtiter חממה תרביות רקמה humidified (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) עבור למשל, 6, 12 ו- 24 שעות ביממה. על מנת למנוע הפרעה עם קובץ מצורף allantois, אל תזיז את הצלחות microtiter בין נקודות זמן אלה.</li>
	<li>בכל נקודה בזמן, ציון allantois מצורף (לדוגמה, allantois אין קובץ מצורף/צף; allantois באופן חלקי או מלא מצורף; מלא התפשטות allantois) באמצעות מיקרוסקופ מצויד שלב חדות או דיפרנציאלית אופטיקה חדות הפרעות, 5 × או 10 × אובייקטיבי (איור 2). הערה: נציג דוגמאות allantoides מבודדים לחלוטין המצורפת טרי מוצגות באיור2. Ex עם רחם, בקצה הדיסטלי של allantoides מבודד wildtype C57BL/6J עכברים מייחסת בתוך 4-6 שעות (זה מכונה החלקי של allantois), והוא מלא מצורף של allantois שלמה הושג בתוך ~ 12 שעות של תרבות. מאת ה' 18-24, explant שיטוח, הניח צורה מעגלית (המכונה כמו במלואם התפשטו allantois) עם CD31-חיוביות וסקולרית פלקסוס9,16.</li>
</ol>5. כתמים מאשרות Allantois Explanted על CD31 סמן התא אנדותל
<ol><li>האחות המדיום תרבות של מלא התפשטות explants ולתקן את התאים על-ידי הוספת µL 40/טוב של 4% (w/v) paraformaldehyde/PBS. הערה: Paraformaldehyde הוא רעיל. ללבוש כפפות ומשקפי מגן בטיחות כדי למנוע העור, קשר עין.</li>
	<li>תקופת דגירה של 10 דקות-RT, ולאחר מכן וארוקן את תגובת שיקוע. לשטוף שלוש פעמים על-ידי הוספת µL 40/טוב של PBS, ולהסיר את המדיום כביסה בשאיבה עדינה.</li>
	<li>Permeabilize התאים לחסום אתרי קישור שאינם ספציפיים על-ידי הוספת µL 40/טוב של 0.1% (v/v) בסרום עז נורמלי טריטון X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (וי/v) ב- PBS למשך 30 דקות בשטיפת RT. פעמיים על-ידי הוספת µL 40/טוב של PBS ו להסיר את המדיום הכביסה על ידי יניקה עדינה. הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות למשך הלילה בשלב זה.</li>
	<li>כתם תאים על-ידי הוספת µL 20/טוב של נוגדנים נגד ראשי-CD31 מדולל 1:50 ב- 0.1% (w/v) BSA/PBS בן לילה ב 4 º C. לשטוף שלוש פעמים על-ידי הוספת µL 40/טוב של PBS, ולהסיר את המדיום כביסה בשאיבה עדינה.</li>
	<li>לזהות נוגדנים העיקרי המאוגד על-ידי הוספת µL 20/טוב של נוגדנים אנטי חולדה עם התווית fluorescently עז משני 1:200 מדולל ב- 0.1% (w/v) BSA/PBS עבור h 1 RT. הגן על צלחות microtiter מן האור על ידי גלישת בנייר אלומיניום או על-ידי הצבת בחדר חשוך. לשטוף שלוש פעמים על-ידי הוספת µL 40/טוב של PBS, ולהסיר את המדיום כביסה בשאיבה עדינה.</li>
	<li>להטביע תאים על-ידי הוספת µL 20/טוב של הרכבה בינונית. תקופת דגירה של ~ 1 h ב- RT עד המדיום הרכבה התחזק. חנות צלחות microtiter ב RT או ב 4 ° C, מוגן מפני אור.</li>
	<li>תמונה מקלעת כלי הדם של allantois explants תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד עם × 5 או 10 × אובייקטיבית, מסנני קרינה פלואורסצנטית מתאימים. הערה: להחליפן בתמונות של מקלעת כלי הדם CD31-חיוביים של allantois התפשטה לגמרי מוצגות באיור3. סמנים אחרים עבור מקלעת כלי הדם, כגון נוגדנים מכוונת נגד Flk-1, טיסה, העניבה-1 או 2 העניבה יכול לשמש היטב16.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+development:+lessons+from+mouse+mutants.">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).</li><li>Segerer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+developmental+function+for+murine+phosphoglycolate+phosphatase+in+safeguarding+cell+proliferation.">An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation.</a> Sci Rep. 6, 35160 (2016).</li><li>Kane, S. V., Acquah, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+transport+of+immunoglobulins:+a+clinical+review+for+gastroenterologists+who+prescribe+therapeutic+monoclonal+antibodies+to+women+during+conception+and+pregnancy.">Placental transport of immunoglobulins: a clinical review for gastroenterologists who prescribe therapeutic monoclonal antibodies to women during conception and pregnancy.</a> Am J Gastroenterol. 104 (1), 228-233 (2009).</li><li>Xu, X., Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+absorption,+distribution,+metabolism,+and+excretion+studies+of+therapeutic+biologics.">Challenges and opportunities in absorption, distribution, metabolism, and excretion studies of therapeutic biologics.</a> AAPS J. 14 (4), 781-791 (2012).</li><li>Wesolowski, S. R., Kasmi, K. C., Jonscher, K. R., Friedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origins+of+NAFLD:+a+womb+with+a+clue.">Developmental origins of NAFLD: a womb with a clue.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 81-96 (2017).</li><li>Racicot, K., Mor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+associated+with+viral+infections+during+pregnancy.">Risks associated with viral infections during pregnancy.</a> J Clin Invest. 127 (5), 1591-1599 (2017).</li><li>Grandjean, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life-Long+Implications+of+Developmental+Exposure+to+Environmental+Stressors:+New+Perspectives.">Life-Long Implications of Developmental Exposure to Environmental Stressors: New Perspectives.</a> Endocrinology. 156 (10), 3408-3415 (2015).</li><li>Inman, K. E., Downs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+allantois:+emerging+paradigms+in+development+of+the+mammalian+umbilical+cord+and+its+relation+to+the+fetus.">The murine allantois: emerging paradigms in development of the mammalian umbilical cord and its relation to the fetus.</a> Genesis. 45 (5), 237-258 (2007).</li><li>Arora, R., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+allantois:+a+model+system+for+the+study+of+blood+vessel+formation.">The murine allantois: a model system for the study of blood vessel formation.</a> Blood. 120 (13), 2562-2572 (2012).</li><li>Watson, E. D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+structures+and+transport+functions+in+the+mouse+placenta.">Development of structures and transport functions in the mouse placenta.</a> Physiology (Bethesda). 20, 180-193 (2005).</li><li>Yang, J. T., Rayburn, H., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+events+mediated+by+alpha+4+integrins+are+essential+in+placental+and+cardiac+development.">Cell adhesion events mediated by alpha 4 integrins are essential in placental and cardiac development.</a> Development. 121 (2), 549-560 (1995).</li><li>Gurtner, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+murine+VCAM1+gene:+essential+role+of+VCAM-1+in+chorioallantoic+fusion+and+placentation.">Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation.</a> Genes &amp; development. 9 (1), 1-14 (1995).</li><li>Kwee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+development+of+the+embryonic+and+extraembryonic+circulatory+systems+in+vascular+cell+adhesion+molecule+(VCAM-1)+deficient+mice.">Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice.</a> Development. 121 (2), 489-503 (1995).</li><li>Downs, K. M., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+into+early+placental+ontogeny:+allantoic+attachment+to+the+chorion+is+selective+and+developmentally+regulated.">An investigation into early placental ontogeny: allantoic attachment to the chorion is selective and developmentally regulated.</a> Development. 121 (2), 407-416 (1995).</li><li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice.">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).</li><li>Downs, K. M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+murine+allantois+by+allantoic+explants.">Study of the murine allantois by allantoic explants.</a> Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).</li><li>Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+pre-placental+tissues+reveals+that+the+allantois+is+required+for+maintained+expression+of+Gcm1+and+Tpbpalpha.">Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha.</a> Placenta. 47, 12-23 (2016).</li><li>Zeigler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allantois+and+chorion,+when+isolated+before+circulation+or+chorio-allantoic+fusion,+have+hematopoietic+potential.">The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential.</a> Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).</li><li>Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+atlas+of+the+integrin+adhesome.">Functional atlas of the integrin adhesome.</a> Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בנוכחות סרום, המהווה מקור עשיר של מולקולות פרו-דבק מטריצה חוץ-תאית כגון fibronectin, allantois explants ייצמד בקלות שונים פלסטיק, זכוכית או מסנן משטחים9,16. לפיכך, אם מטרת וזמינותו שבוצעו היא לחקור באופן ספציפי את האפקט של שינוי גנטי או כל טיפול אחר על הקובץ המצורף allantois מתא?...

השליה היא הכרחית לצמיחה עובריים ופיתוח בסביבת הרחם. היא מהווה את הממשק חמצן, מטבוליט של exchange התזונתי בין מחזור הדם העוברי, אימהית, גם פונקציות כמו איבר האנדוקרינית ו. כל עלבון אנדוגני או אקסוגני זה פוגע פיתוח היפרדות יכול להוביל פיגור גדילה תוך רחמי, אובדן עוברית או סיבוכים בהריון, בעכברים והן בני אדם1. בעוד המספר של העכבר יישוב מוטציות הגורמות פיזיולוגיה היפרדות חריג ממשיך לגדול2, עם אחרים 219 שמפורט כרגע באתר מידענות הגנום העכבר (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), שרבים פנוטיפים אלה אינם מובנים היטב מנקודת מבט מכניסטית. בנוסף שינויים גנטיים, מולקולה קטנה סמים, נוגדנים חד-שבטיים, רעלים, פתוגנים, מטבוליטים עודף או סוכנים סביבתיים שונים עלול להשפיע על התפתחות השליה, הפונקציה3,4,5 , 6 , 7. ובכל זאת, פשוט במבחנה assays מודל שלבים קריטיים בפיתוח השליה נדירים.
פיתוח היפרדות מאתר תופעל ב- midgestation מוקדם, כאשר allantois (מבשר התפתחותית של הטבור) מתגלה מהקצה האחורי של העובר ניצן שגדל לעבר chorion8. Chorioadhesive תאים בשכבה החיצונית של ניצן allantoic לתווך את הקובץ המצורף, הפצת allantois על פני השטח של chorion (chorioallantoic "פיוז'ן"). Chorion לאחר מכן מתקפל לתוך villi בו להערכת של allantois גדל כדי ליצור את המבוך, השכבה הפנימית היפרדות איפה מזינים וחמצן מוחלפים בין דם אימהי צמוד juxtaposed sinusoids וכלי עובריים9 ,10.
הקובץ המצורף של allantois chorion השלב הראשוני וקריטיים אינפורמציה במבוך, פגמים בתהליך זה הם בין הגורמים הנפוצים ביותר lethality עובריים midgestation1. למרות מספר מוטציות העכבר תוארו שבו המצורף chorioallantoic נכשל להופיע10, מסד הנתונים MGI כיום רשימות 108 מוטציות העכבר המאופיינת על ידי היתוך chorioallantoic חריג (http:// www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824), האינטראקציה המערכת בין תא דם אדהזיה מולקולה-1 (VCAM-1, לידי ביטוי את והמזודרם allantoic) לבין אינטגרין α4β1 (לידי ביטוי את mesothelium כוריוני, אשר נגזר והמזודרם extraembryonic) שנראה הכרחי עבור הקובץ המצורף chorioallantoic ופיוז'ן11,12,13. נוגדן כולה-הר פראי-סוג העובר הראו כי VCAM-1 מבוטא בתוך דיסטלי לשני-שליש הקנה allantoic ביום כ עובריים (E) 7.513 (שלב somite 1-4), כי הביטוי שלה נותרת גבוהה במהלך המצורף chorioallantoic - פיוז'ן11,12. כשל מהתופעה allantoic chorion מזוהה בדרך כלל על ידי ניתוח היסטולוגית של הרחם ניצנים. אולם, גדלים allantois הן מבחינה פיזיולוגית מאוד משתנה בין ובתוך אפילו המלטות של אותו שלב התפתחותי14, allantois יכולה רק לצרף chorion מתי זה הגיע בגודל מספיק ליצור מגע גופני. המשקף השתנות טבעי, מצורף chorioallantoic לוקח מקום מתישהו בין ~ E 8.0 ו- E 9.0 בתוך הרחם, הערכה סטטיסטית אמין של תהליך זה על ידי היסטולוגיה היא לפיכך תלויים הניתוח של מספר גדול של conceptuses להשיג מספיק דגימות בשלב ההתפתחותי המתאים.
כאן, אנו מתארים שיטה להערכת המצורף allantoic לשעבר עם רחם זה פחות תלויים בגודל allantois. נדגים את הקרע של העכבר עוברי, allantoides שלהם מ- uteri של עכברים בהריון ~ 8 ימים פוסט coitum (dpc; dpc 0.5 מייעד את הגילוי של פקק הנרתיק), ואת התרבות עוקבות של allantois explants על α4β1 קיבוע אינטגרינים. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה, פונקציונלי של הקובץ המצורף והפצת התנהגות של explants allantois מרובות במקביל, בנקודות זמן שונות רצופים. ניתן להשתמש בפרוטוקול למסך על ההשפעות של מוטציות יישוב, סמים או גורמים סביבתיים שונים על allantois קובץ מצורף ex-vivo.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J wildtype mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Stock No:&amp;nbsp;000664</td><td></td></tr><tr><td>70 % (v/v) Ethanol</td><td>VWR International</td><td>930031006</td><td></td></tr><tr><td>Standard pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>Forceps used to open the abdominal cavity.</td></tr><tr><td>Micro dissecting forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Straight blades.</td></tr><tr><td>Spring scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td>Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.</td></tr><tr><td>Microspoon</td><td>Carl Roth</td><td>AT18.1</td><td>5 mm Spoon diameter.</td></tr><tr><td>Microtiter plates</td><td>ibidi</td><td>81501</td><td>We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 &amp;micro;L) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-&amp;#945;4&amp;#946;1-mediated binding to plastic.</td></tr><tr><td>10 cm dish</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Sterile tissue culture dishes.</td></tr><tr><td>3.5 cm dish</td><td>Nunc</td><td>150288</td><td>Sterile tissue culture dishes.</td></tr><tr><td>Large orifice pipette tips&amp;nbsp;</td><td>Biozym</td><td>VT0140X</td><td>Low binding pipette tips, 200 &amp;micro;L.</td></tr><tr><td>&amp;#945;4&amp;#946;1 integrin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>6054-A4</td><td>Murine &amp;#945;4&amp;#946;1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>Without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03600</td><td>The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; but no L-glutamine, which is added separately.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140-122</td><td>100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 &amp;micro;g/mL streptomycin) stock solution.&amp;nbsp;Prepare and store aliquots at -20 &amp;deg;C to avoid freeze/thaw.</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 &amp;deg;C to avoid freeze/thaw.</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td>We use heat-inactivated FBS (heated to 56 &amp;deg;C for 30 min with mixing to inactivate complement).</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 &amp;micro;m pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;para&lt;/em&gt;-Formaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>0335.2</td><td>To make a formaldehyde solution in PBS, weigh &lt;em&gt;para&lt;/em&gt;-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 &amp;deg;C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 &amp;deg;C for approximately four weeks.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.</td></tr><tr><td>&amp;#945;-CD31 Antibodies</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.</td></tr><tr><td>Secondary goat anti-rat antibodies</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11006</td><td>Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td>Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000</td></tr><tr><td>Labovert&amp;nbsp;</td><td>Leitz</td><td>Labovert&amp;nbsp;</td><td>Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>M80</td><td>Leica Microsystems</td><td>M80</td><td>Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.</td></tr><tr><td>DM4000B</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM4000B</td><td>Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>JVC</td><td>KY-F75U</td><td>3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.</td></tr></tbody></table>

dissection and explant culture of murine allantois for the in vitro analysis of allantoic attachment

השליה היא חיונית עבור הצמיחה וההתפתחות של עוברי יונקים. מסיבה זו, רבים שינויים גנטיים ועלבונות סביר גם סביבתי זה להפריע התפתחות השליה או לפונקציה יכול לגרום לאבדן הריון מוקדם בעכברים ובבני אדם. למרות זאת, פשוט במבחנה מבחני על המסך עבור תופעות אפשריות על היווצרות השליה חסרים. כאן, אנו מתמקדים מידול הצעד הראשון וקריטיים היווצרות השליה, אשר מורכב הקובץ המצורף של allantois chorion. אנו מתארים שיטה להעריך במהירות את הקובץ המצורף של explants allantoic על α4β1 קיבוע אינטגרין, המשמש מצע chorio-מימטי. גישה זו במבחנה מאפשרת הערכה איכותית של הקובץ המצורף והפצת התנהגות של explants allantois מרובים בנקודות זמן שונות ברציפות. הפרוטוקול עשוי לשמש כדי לחקור את ההשפעה של העכבר יישוב מוטציות, סמים או גורמים סביבתיים שונים, אשר קושרו הריון סיבוכים או אובדן העובר על allantois קובץ מצורף ex-vivo.

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד, explant allantoides מאתר ex-vivo, ומפרט את ההערכה איכותי של הקובץ המצורף allantois α4β1 אינטגרין, תהליך קריטי במהלך ויוו chorioallantoic פיוז'ן. התוצאות נציג באיור איור 1A–H מדגימים את השלבים רצופים של בידוד allantois החל מהרחם ב?...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment at JoVE.com

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

אנו מתארים הנועד במבחנה דגם chorioallantoic מצורף, בשלב הראשון של היווצרות השליה. הפרוטוקול מדגים התרבות לנתיחה, explant של allantoides מאתר על קיבוע α4β1 אינטגרין. קובץ מצורף allantois מוערך ברמה המיקרוסקופית בנקודות זמן שנקבע מראש.

דיסקציה והתרבות Explant של Allantois מאתר לניתוח במבחנה של קובץ מצורף Allantoic

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

dissection-explant-culture-murine-allantois-for-vitro-analysis

Research

JoVE Journal

Medicine

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

7.8K Views.  University of Würzburg. אנו מתארים הנועד במבחנה דגם chorioallantoic מצורף, בשלב הראשון של היווצרות השליה. הפרוטוקול מדגים התרבות לנתיחה, explant של allantoides מאתר על קיבוע α4β1 אינטגרין. קובץ מצורף allantois מוערך ברמה המיקרוסקופית בנקודות זמן שנקבע מראש.

Video: Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

באמצעות In Vivo , רקמות, תאים Explant גישות ללמוד מורפוגנזה ו פתוגנזה של הלידה של אבי העורקים

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Developmental Biology

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine development of the embryo. Although genetic data from knockout (KO) mice are convincing, it is not realistic to generate KO mice for all genes as needed. In addition, performing in vivo rescue experiments to consolidate the data obtained from KO mice is not convenient. To overcome these limitations, the Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) explant culture was developed as an appropriate system to study hematopoietic stem cell (HSC) development. Especially for rescue experiments, it can be used to recover the impaired hematopoiesis in KO mice. By adding the appropriate chemicals into the medium, the impaired signaling can be reactivated or up-regulated pathways can be inhibited. With the use of this method, many experiments can be performed to identify the critical regulators of HSC development, including HSC related gene expression at mRNA and protein levels, colony formation ability, and reconstitution capacity. This series of experiments would be helpful in defining the underlying mechanisms essential for HSC development in mammals.

This protocol describes using cultured Aorta-Gonad-Mesonephros for expression analyses, colony-forming units in the culture and spleen, and long-term reconstitution to determine the effect of regulatory factors and signaling pathways on hematopoietic stem cell development. This has been demonstrated as an effective system for studying hematopoietic stem cell biology and function.

היישום של מערכת העורקים-בלוטת המין-mesonephros Explant התרבות Hematopoiesis התפתחותית

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Immunology and Infection

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גירוי קולטן הכרת תרבות תבנית של עכבר המעיים Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

שלית Decidual אדם תרבויות איברים ללמוד זיהומים בבית הממשק האם והעובר

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental treatments. However, because of their small body size, some structures, such as the oviduct with a diameter of 200-400 &#956;m, have proven to be relatively difficult to study except by immunohistochemistry. Recently, immunohistochemical studies have uncovered more complex differences in oviduct segments than were previously recognized; thus, the oviduct is divided into four functional segments with different ratios of seven distinct epithelial cell types. The different embryological origins and ratios of the epithelial cell types likely make the four functional regions differentially susceptible to disease. For example, precursor lesions to serous intraepithelial carcinomas arise from the infundibulum in mouse models and from the corresponding fimbrial region in the human fallopian tube. The protocol described here details a method for microdissection to subdivide the oviduct in such a way to yield a sufficient amount and purity of RNA necessary for downstream analysis such as reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing (RNAseq). Also described is a mostly non-enzymatic tissue dissociation method appropriate for flow cytometry or single cell RNAseq analysis of fully differentiated oviductal cells. The methods described will facilitate further research utilizing the murine oviduct in the field of reproduction, fertility, cancer, and immunology.

A method for microdissection of the mouse oviduct that allows collection of the individual segments while maintaining RNA integrity is presented. In addition, non-enzymatic oviductal cell dissociation procedure is described. The methods are appropriate for subsequent gene and protein analysis of the functionally different oviductal segments and dissociated oviductal cells.

ניתוח מיקרו-דיסקט וניתוק של אובידוקט מורין: זיהוי מקטע בודד ובידוד תא בודד

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Assay Explant להערכת התנהגות ניידת של mesenchyme הגולגולת

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Biology

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

תרבית משותפת של אורגנואידים אפיתליאליים של המעי הדק של מורין עם תאי לימפה מולדים

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Establishing Villous and Decidual Organ Cultures as Ex Vivo Models of Human Maternal-Fetal Interface

Source: Rizzuto, G. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54237">Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the establishment of primary human placental villous and decidual organ cultures in ex vivo conditions. These models are well-suited for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface.

ביסוס תרביות איברים נשירים ונשירים כמודלים אקס ויוו של ממשק אם-עובר אנושי

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

דיסקציה והתרבות Explant של Allantois מאתר לניתוח במבחנה של קובץ מצורף Allantoic

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video