Name: using in vitro live-cell imaging to explore chemotherapeutics delivered by lipid-based nanoparticles
Uploaded: 2017-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles at JoVE.com

המתקנים מיקרוסקופ המשמש חלק המרכז דימות אופטי ארסמוס, אנחנו רוצים להודות לצוות OIC עבור שירותיהם.

1. הכנה <ol><li>להרכיב לחדר ההדמיה, אשר מורכב משני חלקים-
	<ol><li>מקום 25-מ מ כיסוי זכוכית ( איור 1 א'-1) בחלק התחתון של החדר ( איור 1 א'-2), להבריג את החלק העליון בחלק התחתון ( איור 1 א'-3). לא להדק חזק מדי, כפי יכול לשבור את הזכוכית. אוטוקלב התא כולו ( איור 1 א' -4).</li>
	</ol></li> <li>להכין בינוני התרבות התא על-ידי שכשהם Dulbecco &#39; s נשר שונה &#39; s בינוני (DMEM) ללא פנול אדום עם 10% חום-לא פעיל עגל עוברית סרום (FCS) ולא 1 מ"מ-גלוטמין בתנאים סטריליים. החנות 4 ° C וחמים עד 37 ° C לפני השימוש.</li>
	<li>לשמור על התאים עם תא תרבות במדיום culturing מבחנות בטכניקות תרבות תא רגיל. 
	הערה: כאן, שתי שורות תאים העכבר, מלנומה B16BL6 11 ולואיס ריאות קרצינומה (LLC), ואת שני מלנומה אנושיים, BLM ו- 1F6 12, שימשו.</li>
	<li>הופכים את הג'לטין 0.1% על ידי שקילה המסת הג'לטין בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לעקר את הפתרון על-ידי סינון זה דרך מסנן 0.22-מיקרומטר ואחסן אותו ב-4 מעלות צלזיוס</li>
</ol> 2. צלחת תאים <ol><li>להסיר תא הדמיה של השקית עיקור ב- cabinet זרימה שכבתית, בזהירות להדק את התא, ולמקם אותו בצלחת פטרי. 
	הערה: כדי למנוע זיהום, להשאיר לחדר ההדמיה בצלחת פטרי עד החדר ניתן למקם תחת המיקרוסקופ.</li>
	<li>מעיל הזכוכית של תא הדמיה עם 1 מ"ל של ג'לטין סטרילי 0.1% במשך 20 דקות-CO של 37 ° C ו- 5%-2- 
	הערה: פעולה זו תאפשר יותר מצורף תא.</li>
	<li>להסיר את המדיום המבחנות התרבות התא (ראה שלבים 1.2 ו- 1.3), לשטוף פעם עם 1 x PBS ולנתק את התאים באמצעות טריפסין 0.25%. בטל את טריפסין על-ידי הוספת תא תרבות בינוני לאסוף את התאים, ספין אותם למטה ב g x 1,100 במשך 5 דקות, resuspend בגדר ב 5 מ של התא תרבות בינונית.</li>
	µL <li>µL 20 לדלל תא השעיה עם 20 של trypan blue (אשר תועבר ידי תאים מתים). ספירת מספר התאים חי וגם מת באמצעות hemocytometer; מספר תאים מתים לא יעלה על 10%.</li>
	<li>תשאף הג'לטין, צלחת התאים לדילול המאפשר לכל היותר 70% כיסוי בתוך 24 שעות. לדוגמה, השתמש לדילול של 5 x 10 4 או 10 x 10 תאים 4 ב 1 מ"ל. לאפשר את התאים לדבוק ב 5% CO 2 ו- 37 מעלות צלזיוס במשך ה 24</li>
</ol> 3. זמן לשגות מיקרוסקופ ( איור 2) הערה: כאן, השתמשו מיקרוסקופ קונפוקלי עם בעל שלב בהזמנה אישית, למרות מייצרת רוב מציעים מגוון של חממות עבור תאים חיים הדמיה זה הם מתאים גם לחקור משלוח הסמים nanoparticulated.
<ol><li>להעריך את התאים במיקרוסקופ confluency, מורפולוגיה הסלולר של זיהום. מקם את התא בחזרה בחממה 2 CO. 
	הערה: confluency לא יעלה על 70%. אם המורפולוגיה הסלולר הוא לא עקבי (קרי, התאים אינן מתיישבות) או זיהום מזוהה, למחוק תא הדמיה-</li>
	<li>לעבור על מיקרוסקופ קונפוקלי ( איור 1E-1), אור פלורסנט ( איור 1E-2) ומחשב ( איור 1E-3)-</li>
	<li>להתחבר החימום עדשה המטרה ולהגדיר אותו עד 35 ° צ' ( איור 1E -4 + insert).</li>
	<li>להכין את היחידה דגירה, כפי שמוצג באיור 1B. 
	הערה: יחידה זו מורכבת שלב מחוממת ( איור 1B-1), שלב זרימה עם מחבר עבור 2 CO הצינורות ( איור 1B-2) ו- CO 2 בדיקה ( איור 1B -3), ואת כתם אדום הסגירה ( איור 1B-4). תיקון זה משמש כדי לסגור באופן זמני את יחידת עד לחדר ההדמיה מושם.</li>
	<li>מקום ביחידה אינקובציה על הבמה מיקרוסקופ וחבר בו -out - flow CO 2 הצינורות ( איור 1E-5). לפתוח את השסתום 2 CO המרכזי ( איור 1E-6) ולעבור בבקר 2 CO ( איור 1E-7). בדוק הבקר מוגדר כ- 5% CO 2. 
	הערה: עבור לחות, CO 2 עובר דרך מכשיר לחות ( איור 1E -8). לניסויים היפוקסיה, הרגולטור 2 O נפרד ( איור 1E-9) נכלל בכיוונון.</li>
	<li>להגדיר את הטמפרטורה הבמה 37 ° C ( איור 1E-10). לניסויים היפרתרמיה, הגדר את הטמפרטורה 42 ° C. אפשר יחידת הדגירה כדי להגיע טמפרטורה שנבחר, CO 2 אחוז.</li>
	<li>לקחת לחדר ההדמיה של המפקד הראשי חממה 2 ומובילים התא בצלחת פטרי לחדר מיקרוסקופ.</li>
	<li>מקום לחדר ההדמיה ( איור 1A-4) בהזמנה אישית, 35 מ מ קוטר הבמה מחזיק ( איור 1 א'-5) ולסגור את התא עם מכסה איטום בהזמנה אישית ( איור 1A-6). 
	הערה: המכסה מאפשר CO 2 לעבור ומונעת אידוי וזיהום.
	<ol><li>לפתוח ביחידה אינקובציה, החלף את התיקון אדום לחדר ההדמיה, וסגור את יחידת ( איור 1C). . תעשה את זה מהר ככל האפשר כדי למנוע את הקירור של התאים ודא כי ללא כבלים תקועים בין הבמה לבין המיקרוסקופ.</li>
	</ol></li> <li>לעזוב את היחידה להתאקלם במשך 30 דקות</li>
	<li>לפתוח את התוכנה ולעבור על הלייזרים. 
	הערה: כאן, 488 ננומטר ארגון, 543 nm הליום-ניאון, 633 ננומטר הליום-ניאון לייזרים שימשו.</li>
	<li>להפוך מסד נתונים חדש על-ידי לחיצה על &#34; ניו &#34; תחת הכרטיסיה קובץ שם ולשמור את מסד הנתונים.</li>
	<li>להגדיר את התצורה באמצעות לחיצה על &#34; Config &#34; תחת הכרטיסיה ידרשו בחר &#34; מצב ערוץ &#34;, &#34; מסלול יחיד &#34; כדי להעריך את fluorophore של יחיד או &#34; רב המסלול &#34; עבור מספר fluorophores. בחר את הלהקה המתאים-לעבור מסננים תואמים את fluorophore (למשל, 560 כדי 615 ננומטר מסנן לעבור הלהקה dox ו Dox-NP; ראה התוצאות נציג לקבלת דוגמאות נוספות). בחרו בערוץ שדה בהיר אחד של המסילה.</li>
	<li>להגדיר את הפקד סריקה באמצעות לחיצה על &#34; סרוק &#34; תחת הכרטיסיה ידרשו להגדיר גודל המסגרת (1,024 x 1,024), מהירות סריקה (אופטימלי), לסרוק כיוון (8 סיביות, יחיד), ולאחר סרוק ממוצע (4) על-ידי לחיצה &#34; מצב. &#34; להגדיר את חריר (200 מיקרומטר), לזכות והיסט ( למשל, 580 700, 835; ראה איור 3), לייזר כוח (488 = 10%, 543 = 100%, 633 = 100%) על ידי לחיצה &#34; ערוצים. &#34;</li> <li>לשמור הגדרות אלה על-ידי לחיצה על &#34; Config &#34; בתצורה טאב ולשמור אותם במסד הנתונים של התצורה.</li>
	<li>להגדיר מואץ על ידי לחיצה &#34; X זמן רב &#34; ( איור 1D) היחידים מאקרו לחץ &#34; יחיד מיקום &#34;.</li>
	<li>לשמור את התאים בפוקוס, בחר את הפוקוס האוטומטי המאקרו על-ידי לחיצה על &#34; פוקוס אוטומטי. &#34; 
	הערה: פוקוס אוטומטי מושגת עם 633 ננומטר לייזר באמצעות ההשתקפות של הזכוכית כנקודת התייחסות.</li>
	<li>להחיל את התצורה שנשמרה על-ידי לחיצה על &#34; מסלול יחיד &#34; או &#34; רב המסלול, &#34; גלילה לתצורה הנדרשת במסד הנתונים של התצורה, הגדרת את מרווח הזמן (למשל, 15 דקות), מספר סריקות (למשל, 97), לחיצה על &#34; טען Config. &#34; הערה: באמצעות הגדרות אלה, זמן-סדרת 97 x 15 min = 24 שעות ייעשה.</li>
	<li>שם מואץ ב &#34; שם קובץ בסיס &#34;, בחר את מסד הנתונים (שנעשתה בשלב 3.11) על ידי לחיצה &#34; בסיס הנתונים של תמונת &#34; לשמירת מואץ. להגדיר תיקייה זמנית על-ידי לחיצה על &#34; Tmp תמונת התיקיה. &#34; הערה: אם המערכת מפסיקה או קורסת מכל סיבה שהיא, התמונות ממוקמים בתיקיה זו.</li>
	<li>פתח את יחידת ומוכנסות, הרם את הטבעת הדמיה, להוסיף טיפה של שמן טבילה המטרה, וסגור את יחידת מהר ככל האפשר. להתמקד ולבחור עמדה בבית הבליעה הדמיה- 
	הערה: עמדה זו מכילה תאים טפט, עם מינימום של 70% confluency, המאפשר ההדמיה של תאים בודדים.</li>
	<li>לבדוק את הגדרות התצורה עבור הרקע ולתקן במידת הצורך. 
	הערה: ניתן לתקן את הרקע על-ידי הפחתת הכוח רווח או לייזר. כל שינוי בתצורה צריך להינצל (ראה שלב 3.17) והוא טעון (ראה שלב 3.18) שוב במאקרו.</li>
	<li>ב זרימה שכבתית cabinet, לדלל סמים חינם או חלקיקים ריכוז סמים µg/mL 5 או µmol 0.05 של ליפידים במדיום התרבות תאים. לסנן דרך מסנן מזרק 0.22-מיקרומטר אם הסמים/חלקיקים אינם סטריליים.</li>
	<li>פתח את התא ומוכנסות, הרם את המכסה איטום, להסיר את המדיום של התאים, להוסיף 1 מ"ל של סמים מדולל/חלקיקים, וסגור את יחידת מהר ככל האפשר.</li>
	<li>מתמקדים התאים ואת ההתחלה מואץ על ידי לחיצה &#34; שעת התחלה &#34; במאקרו X זמן רב.</li>
	<li>לבדוק באופן קבוע כדי לראות אם התאים נמצאים עדיין בפוקוס או להשתמש את פוקוס אוטומטי (ראה שלב 3.16). התוכנית שומר באופן אוטומטי מואץ במסד הנתונים; לא לסגור את מסד הנתונים בעת הפעלת התוכנית.</li>
</ol> 4. ניתוח נתונים <ol><li>בהתאם שאלת המחקר המקורי, להשתמש בתוכנות כגון ImageJ לניתוח נתונים (עיין בסעיף התוצאות לדוגמאות).</li></ol>

<ol>
	<li>Duggan, S. T., Keating, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pegylated+liposomal+doxorubicin:+a+review+of+its+use+in+metastatic+breast+cancer,+ovarian+cancer,+multiple+myeloma+and+AIDS-related+Kaposi's+sarcoma.">Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma.</a> Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).</li><li>Gabizon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+circulation+time+and+enhanced+accumulation+in+malignant+exudates+of+doxorubicin+encapsulated+in+polyethylene-glycol+coated+liposomes.">Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes.</a> Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).</li><li>Ten Hagen, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+tumor+necrosis+factor-alpha+augments+antitumor+activity+of+stealth+liposomal+doxorubicin+(DOXIL)+in+soft+tissue+sarcoma-bearing+rats.">Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats.</a> Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).</li><li>Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+low-dose+tumor+necrosis+factor-alpha+to+systemic+treatment+with+STEALTH+liposomal+doxorubicin+(Doxil)+improved+anti-tumor+activity+in+osteosarcoma-bearing+rats.">Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats.</a> Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).</li><li>Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+safety+of+pegylated+liposomal+doxorubicin+(Doxil/Caelyx)+demonstrated+by+endomyocardial+biopsy+in+patients+with+advanced+malignancies.">Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies.</a> Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).</li><li>Muggia, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+encapsulated+anthracyclines:+new+therapeutic+horizons.">Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons.</a> Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+content+release+from+optimized+stealth+thermosensitive+liposomes+using+mild+hyperthermia.">Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia.</a> J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).</li><li>Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+optimization+of+idarubicin+thermosensitive+liposomes+provides+ultrafast+triggered+release+at+mild+hyperthermia+and+improves+tumor+response.">Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response.</a> J Control Release. 220, 425-437 (2015).</li><li>Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+Doxil+is+taken+up+intracellularly+and+released+doxorubicin+sequesters+in+the+lysosome:+Evaluated+by+in+vitro/in+vivo+live+cell+imaging.">Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging.</a> J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).</li><li>Dicheva, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+Thermosensitive+Liposomes:+A+Novel+Dual+Targeted+Heat-Triggered+Drug+Delivery+Approach+for+Endothelial+and+Tumor+Cells.">Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells.</a> Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).</li><li>Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+anti-tumour+activity+of+recombinant+human+and+murine+TNF,+alone+and+in+combination+with+murine+IFN-gamma,+on+a+syngeneic+murine+melanoma.">In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma.</a> Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).</li><li>Van Muijen, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+expression+of+metastasizing+and+non-metastasizing+human+melanoma+cells+xenografted+into+nude+mice.">Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice.</a> Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).</li><li>Das, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+TIMP3+expression+affects+tumor+progression+and+angiogenesis+in+melanomas+through+regulation+of+directionally+persistent+endothelial+cell+migration.">Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration.</a> Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).</li><li>Brouckaert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+augmented+tumor+response+in+B16BL6+melanoma-bearing+mice+treated+with+stealth+liposomal+doxorubicin+(Doxil)+correlates+with+altered+Doxil+pharmacokinetics.">Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics.</a> Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).</li><li>Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+doxorubicin+efflux+from+the+nucleus+of+drug-resistant+cancer+cells+following+extracellular+drug+clearance.">Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance.</a> Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).</li><li>Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+drift+correction+following+4D+confocal+time-lapse+imaging.">Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+hyperthermia+triggered+doxorubicin+release+from+optimized+stealth+thermosensitive+liposomes+improves+intratumoral+drug+delivery+and+efficacy.">Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy.</a> J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).</li><li>Pedrosa, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+intracellular+Doxorubicin+delivery+through+nanoliposomes+equipped+with+selective+tumor+cell+membrane+permeabilizing+short-chain+sphingolipids.">Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids.</a> Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).</li><li>Pedrosa, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+glycoceramides+promote+intracellular+mitoxantrone+delivery+from+novel+nanoliposomes+into+breast+cancer+cells.">Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells.</a> Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כפי שנצפו בעבר, קיבוע יכול להרוס liposomal nanocarriers כמעט מיד, חייה של DXR שוחררה טופס אלה נהרסה ליפוזומים עדיין היה לי זמן להיכנס לגרעין, שהופך את הפרשנות של נתונים קשה מאוד אפילו מטעה. עם כמה שינויים מיקרוסקופיים, גורל כימותרפיות חיים תאים ורקמות ניתן באופן שגרתי ייבדקו כדי לאשר או להפיל את התצפיות היסטולוגית. עיתון האחרונות הראו את ספיגת שחרור, לוקליזציה של חייה של DXR בתאים לטפל בעזרת dox בחינם, שעברו אנקפסולציה באמצעות הדמיה בצילום מואץ לחיות תאים9. עבודה זו מתארת את הגדרת הניסוי בפירוט רב יותר. באמצעות מודל זה, אפשרי לדמיין את הובלת מיידית dox את הגרעין, איפה זה ברציפות מצטבר עד התא ימות בסופו של דבר. לעומת זאת, כאשר נעשה שימוש Dox-NP, רק כמויות קטנות של dox המשוחררים נמצאים בגרעין. למרות חשיפה מתמשכת תוצאות הצטברות חייה של DXR רציפה, האות פלורסנט הוא נמוך בהרבה ב Dox-NP-לעומת תאים שטופלו dox, המציין הבדל ריכוז הסלולר לבין cytotoxicity הבאים. יתר על כן, באמצעות סמנים לחיות תאים, זה הוצג, בעת חשיפת לתאים Dox-NP, חייה של DXR את nanocarrier ממוקמים על ליזוזום. אפשרות זו מציינת ליפוזום מלאה הוא נלקח על ידי התא ומדגים במעורבות מסלול endocytic במהלך ספיגת של חלקיקים אלה. חייה של DXR בגרעין ברור מן המשוחררים dox. באמצעות שיטה זו, כמו חייה של DXR והן המוביל לשפה משותפת ולא נראה להיות לכודים בתוך lysosomes, זאת עדיין חד משמעית אם זה עוברת אנקפסולציה או משוחרר dox. זה אפשרי כי יציבות פנימית ננו-חלקיק מונע שחרור dox כאשר מותאמים לשפה את ליזוזום.
ב פרוטוקול זה, הוכח הדמיה לחיות תאים באמצעות מלכודת מיקרוסקופיים ספציפי, בעל שלב בהזמנה אישית (המפרט יכול להיות נתון על פי בקשה). עם זאת, מייצרת מיקרוסקופ קונפוקלי ביותר מציעים מגוון רחב של חממות לבצע הדמיה לחיות תאים. שמירה על תנאי התרבות התא (כלומר, טמפרטורה, CO2, pH, לחות ו עקרות) הוא הקריטריון העיקרי של חממות אלה ואינה דורשת כמה בדיקות מקדימות כדי לקבוע את תנאים נאותים, אשר בהמשך מוסברת. גם יכולה להיות מועברת תוכניות רכישה אוטומטית נתונים באתר לפי יצרנים אותו. אפשרות "ריבוי מיקום" מאפשרת לך תמונה במספר תפקידים בבית הבליעה אותה, זיקוק ניתוח סטטיסטי. עם זאת, אפשרות זו בפקודת המאקרו שצוין בכתב היד מחייבת עמדות XYZ קבוע, לפיו האפשרות לתיקון Z-להיסחף אובד. סריקה Z-הממד יכולים להיכלל זה מאקרו, שימושים מוקד מטוס לניתוח. עם זאת, הדבר דורש סריקה נוספת, להגדיל את האפשרות של phototoxicity, הלבנת.
כמו עם כל המדידות פלורסנט, חשיפת יתר היא בעיה, במיוחד בעת השוואת שני מתחמים עם ספיגת הסלולר שונה. עוצמת פלורסנט אינה תלויה על האות מהותי של המתחם, אלא גם על קצב ספיגת, הריכוז, ואת הזמן חשיפה לסמים בלבד. כפי שמוצג באיור 3, גרעיני חייה של DXR תוכן של תאים שטופלו dox הוא כבר גלוי, ואילו אין אות נתפסת בתאים Dox NP-שטופלו. רק על ידי הגדלת הרווח את חייה של DXR בתאים Dox NP-שטופלו ניתן לאבחן, שמוביל חשיפת יתר בתאים שטופלו dox. יתר על כן, אפילו intracellularly, Dox-NP heterogeneously מופץ, אשר יכול לגרום נמנעת תחת- או חשיפת יתר. במיוחד כאשר חוקרים את מלכודת חייה של DXR הסלולר, הרווח צומצם באופן משמעותי כדי להבחין organelles בודדים (דמויות 5B ו- 5 C). לפיכך, המידות המיוצג על-ידי צפיפות פיקסלים חייבים להיות מלווים את התמונות נציג לפרשנות הראויה של תוצאות.
Phototoxicity, הלבנה, יחס אות לרעש נמוך הם גם נושאים חשובים במיקרוסקופ פלואורסצנטי, יש ליצור פשרה בין איכות התמונה ורכישת תמונות. עם זאת, גם כאשר ההגדרה של מיקרוסקופ תהיה אופטימלית, איכות התמונה גם במידה רבה נקבעת לפי האיכות של התאים, המתחם שנוספו. חייה של DXR נותן אות חזק, עם נעשים, הלבנת לא נצפתה, גם לאחר תקופות ארוכות יותר (עד 72 שעות). עם זאת, צמצום של האות פלורסנט יכול להיות גם תוצאה של בזרימת. בזרימת תופעה חשובה ההתנגדות סמים15 , מתרחשת כאשר התאים לשאוב התרופה מאתר תאיים של פעולה. ירידה של האות פלורסנט לאורך זמן ולכן ניתן גם תוצאה של dox בזרימת9. השוואה בין האות פלורסנט של מקום שאינו סרוקים בסוף הניסוי עם התמונה האחרונה מתוך הסדרה זמן לשגות תדגים הלבנת (קרי, האות יהיה גבוה יותר במיקום שאינו סרוקים) או בזרימת (קרי, שניכם אותות יהיו זהים). קיימות מספר אפשרויות הענישה (למשל, הרקע, סחיפה, הלבנה, וכו ') בתוכניות כמו ImageJ16. בנוסף, ככל האינטנסיביות פלורסנט לאורך זמן, הגדרות התצורה ניתן מראש הערכה בניסוי פיילוט כדי למזער חשיפת יתר בסוף זמן לשגות (השלב 3.21). לחלופין, ניתן להשתמש תא הדמיה עם תאים כבר נחשף לסם-בתקופה הרצויה כדי לאתחל את ההגדרות. לבסוף, עבור סוג זה של ניתוח, הסם ריכוזי (שלב 3.22) להימנע והקימו מראש באמצעות ביו-מבחני קונבנציונלי.
תאים תרבותי ומתוחזק באופן רציף במדיום בלי פנול אדום. פנול אדום שזוהר בחלק האדום של הספקטרום, יכול להיות שנצפו ב- organelles הסלולר, lysosomes ככל הנראה, הצגת מידע חיובי-false (שלב 1.2). כדי לאפשר פיקוח על תאים בודדים, תא זרימה לא יעלה על 70% (שלב 3.1.). CO2 הזרימה-המהירות (שלב 3.5) צריך להיות מוסדר בניסוי אימות כאשר נרכש הציוד או אחרי תחזוקה. כאשר המהירות גבוהה מדי, בינוני יתפוגג. כאשר המהירות נמוכה מדי, יגדיל ה-pH של המדיום, אשר יכולה להשפיע על גדילת התאים. המדיום הוא ללא השינויים אינדיקטור פנול אדום pH pH לא יכול להיות שנצפו, ולכן התעלמו בקלות. ברגע הזרם2 CO מאומת, הגדרות אלה יכול לשמש כל ניסויים עתידיים.
באמצעות השיטה המתוארת כאן, גורלו של חלקיקים יכול בקלות ייחקרו באמצעות הדמיה לחיות תאים ומיקרוסקופיה זמן לשגות. בהליך זה, שימשו חלקיקים זמינים מסחרית. עם זאת, גורל thermosensitive17, ליפוזומים cationic10; ליפוזומים מועשר shingolipids קצר-שרשרת18; חלקיקים לבצע סמים אחרים8,19 נחקרו גם באופן זה גידול, תאים נורמליים.

היכולת לעקוב אחר תהליך ביולוגי, כגון תאים תאים אינטראקציות, אינטר-תחבורה תאיים, ספיגת מתחם ציטוטוקסיות ואת אינטראקציית חלבון של מולקולות יחיד בתוך החיים תאים ורקמות, צברה עניין רב במהלך האחרון עשור, כפי שהיא מספקת המימד הנוסף של "בזמן אמת". כתב יד זה, מתוארת שיטה כדי לעקוב אחר גורלם תאיים dox חינם ו dox שולבו חלקיקים (Dox-NP).
חלקיקים שימשו במשך עשרות שנים לטיפול סרטן מסוימים. Dox-NP אושרה לטיפול סרקומה קפוסי הקשורות לאיידס, מתקדם השחלות, השד סרטן, מיאלומה נפוצה1. זה היה אחד של חלקיקים liposomal הראשון פיתח והציג בסביבה קלינית. הצורה החופשית, dox, מנוקה במידה רבה של מחזור הדם, הגבלת הקיבולת שלו כדי להגיע לאתר הגידול בכמויות מספיקות. יתר על כן, טיפול זה מלווה חמורה והגבלת מינון תופעות לוואי, כגון stomatitis ואי ספיקת לב. כאשר מקופל לתוך pegylated liposomal חלקיקים זרימת הזמן מגביר דקות ימים2. סוג זה של כולסטרול המכילים ליפוזום היא די יציבה, יציבות זו קובעת את פרמקוקינטיקה של התרופה במארז.
עם זאת, קשיחות זו יש חיסרון. היכולת ציטוטוקסיות של תרכובת לכיוון תאים סרטניים הוא הראשון הערכה במבחנה, הוכח ש-dox הזה הוא יותר חזק ממה Dox-NP בציטוטוקסיות מבחני3,4. זה היה שיערו כי היציבות של המוביל מונע שחרור, ספיגת הסלולר של הסם, כדאי לחקור את התופעה הזו עוד יותר. המאפיינים liposomal מהותי, נבנה אחרונה המרכיבים אגרסיביות בזרם הדם ולהגיע לאתר הגידול ללא פגע, גרמו הביולוגית לקוי של הרכיב ציטוטוקסיות (קרי: dox) באתר היעד (קרי, הגידול גרעין התא). למרות Dox-NP דיברת שיפור התגובה לעומת הצורה החופשית, זה היה עדיין בעל ערך קליני, כמו עטיפת הקטינה באופן משמעותי את ההשפעות cardiotoxic5. בשנים הבאות, תרכובות אחרות היו אנקפסולציה ננו-נשאים6. בנוסף, שינוי נשאים, גרמו סמים מופעלות שחרור (קרי, באתר הגידול) אך שמר על יציבות ב-7,זרימת הדם8. למרות שנים של חקירה, שימוש קליני, גורל intratumoral nanocarriers כמו Dox-NP עדיין לא ברורות לגמרי בפרסום האחרון, זה הוצג כי ננו-חלקיק הוא נלקח כולו בעוד dox נשאר לכוד ב lysosomes9.
ספיגת הסלולר של שחרור nanoparticle וסמים הם תהליכים דינאמיים שניתן בצורה הטובה ביותר לפקח עליהם באמצעות הדמיה לחיות תאים. יתר על כן, היסטולוגיה קלאסי, שבו תאים מודגרת, לאחר מכן קבועה, יכול לתת תוצאות שגויות אם הקיבעון הורס המוביל liposomal ומציג חפצים. הדרישה המרכזית הדמיה לחיות תאים הוא חזותי, רצוי על ידי קרינה פלואורסצנטית, של התהליך הרצוי. תרכובות מסוימות, כמו dox, יש של פלואורסצנטי אדום פנימי. כמו כן, סמני פלורסנט יכולה להיות מוחדרים המוביל, האברונים ניתן לאבחן באמצעות סמנים לחיות תאים. בדרך זו, מערך של פרמטרים, כמו ספיגת של המוביל, שחרור התרופה, לוקליזציה הסלולר של הספק ושל סמים, יכול להיות עם תמונה, מנותח. . הנה, שיטה מתואר שבו המערכת גורל dox ו Dox-NP בתאי הגידול במספר מלווה בזמן אמת. בנוסף, שיטה זו ניתן להתאים בקלות ליצור תנאים אידיאליים עבור ממוקד (למשל, טעונה חלקיקים10) ועורר שחרור התרופה (למשל, היפרתרמיה7).

<table><tbody><tr><td>DMEM (no phenol-red)</td><td>Sigma</td><td>D1145</td><td>Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS</td></tr><tr><td>Trypsin-versene (EDTA)</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>Heat inactivate for 30 min at 55 &amp;ordm;C</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from bovine skin</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>Make a 0,1% solution in PBS, sterile</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 0,22 &amp;micro;m filter - 500 ml&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Trypan-blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Cells: Lewis lung carcimoma</td><td>ATCC</td><td>CRL-1642</td><td></td></tr><tr><td>Cells: B16BL6</td><td>Dr. P. Brouckaert, Ghent University</td><td>donated</td><td>Ref.10</td></tr><tr><td>Cells: BLM and 1F6</td><td>Dr. van Muijen, University of Nijmegen</td><td>donated</td><td>Ref.11</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>Actavis&amp;nbsp;</td><td></td><td>mentioned as dox in the manuscript</td></tr><tr><td>Doxil/Caelyx</td><td>Janssen-Cilag</td><td></td><td>mentioned as Dox-NP in the manuscript</td></tr><tr><td>Syringe filter 0.2 &amp;micro;m</td><td>VWR international</td><td>10462200</td><td></td></tr><tr><td>Lysotracker-green DND-26</td><td>Invitrogen</td><td>L7526</td><td>mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript</td></tr><tr><td>Lysotracker-red DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td>mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript</td></tr><tr><td>Attofluor cell ring</td><td>Invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass 25 mm #1</td><td>Thermo scientific</td><td>CB00250RA1</td><td></td></tr><tr><td>Stage holder + sealing lid</td><td>Custom made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS LSM 510 microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software LSM 510 version 3.2 SP2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr></tbody></table>

using in vitro live-cell imaging to explore chemotherapeutics delivered by lipid-based nanoparticles

טכניקות הדמיה שגרתיות יכול לספק מידע מפורט אודות תהליכים תאיים. עם זאת, מידע זה מבוסס על תמונות סטטיות בכל מערכת אחרת דינמי, שלבים רצופים בקלות להתעלם או שלא כהלכה. הדמיה לחיות תאים, מיקרוסקופ זמן לשגות, שבו תאים חיים יכול להיות בעקבות שעות או אפילו ימים באופן רציף יותר או פחות, ולכן הם מאוד אינפורמטיבי. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר החקירה על גורלם של חלקיקים כימותרפיות לאחר המסירה של דוקסורוביצין (dox) בתאים חיים. Dox הוא סוכן intercalating זה חייב להשתחרר מן nanocarrier שלה להיות פעילים ביולוגית. למרות רישומה קלינית במשך יותר משני עשורים, את ספיגת, התמוטטות, ושחרור סמים הם עדיין לא מובן במלואו. מאמר זה בוחן את ההיפותזה חלקיקים המבוססת על השומנים שנלקחה על ידי תאים סרטניים והשפילו הם לאט לאט. Dox שפורסמו אז translocated את הגרעין. כדי למנוע קיבוע חפצים, הדמיה לחיות תאים, מיקרוסקופ זמן לשגות, המתוארות בהליך זה ניסיוני, יכול להיות מיושם.

Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles at JoVE.com

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

הדמיה לחיות תאים הוא כלי רב עוצמה כדי לחזות תהליכים דינאמיים. הבחינה של תאים קבוע מספק רק תמונות סטטיות, אשר יכול להוביל פירוש מוטעה ובלבול לגבי התהליך. עבודה זו מציגה שיטה ללמוד ספיגת התרופה שחרור, לוקליזציה תאיים של חלקיקים liposomal בתאים חיים.

שימוש במבחנה לחיות תאים הדמיה כדי לחקור Chemotherapeutics מועברת על ידי חלקיקים המבוססת על שומנים בדם

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

using-vitro-live-cell-imaging-to-explore-chemotherapeutics-delivered

Research

JoVE Journal

Medicine

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

8.4K Views.  Erasmus MC. הדמיה לחיות תאים הוא כלי רב עוצמה כדי לחזות תהליכים דינאמיים. הבחינה של תאים קבוע מספק רק תמונות סטטיות, אשר יכול להוביל פירוש מוטעה ובלבול לגבי התהליך. עבודה זו מציגה שיטה ללמוד ספיגת התרופה שחרור, לוקליזציה תאיים של חלקיקים liposomal בתאים חיים.

Video: Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past decade. However, only a small number of nanomedicines have been approved for clinical use, whereas the majority of nanomedicines under clinical development have produced disappointing results. One major obstacle to the successful clinical translation of new cancer nanomedicines is the lack of an accurate understanding of their in vivo performance. This article features a rigorous procedure to characterize the in vivo behavior of nanomedicines in tumor-bearing mice at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels via the integration of positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), radioactivity quantification methods, flow cytometry, and fluorescence microscopy. Using this approach, researchers can accurately evaluate novel nanoscale formulations in relevant mouse models of cancer. These protocols may have the ability to identify the most promising cancer nanomedicines with high translational potential or to aid in the optimization of cancer nanomedicines for future translation.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

נוהל מקיף כדי להעריך את<em&gt; In vivo</em&gt; ביצועים של סרטן ננו-רפואה

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Cancer Research

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

הערכה של ספיגת nanoparticle ב גידולים בזמן אמת באמצעות הדמיה Intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

חלקיקים נגיפיים עבור<em&gt; בחי</em&gt; הדמית גידול

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Bioengineering

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

חי הדמיה של תגובות סמים בmicroenvironment הגידול במודלים עכבריים של סרטן השד

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

מוצקים שומנים חלקיקים (SLNs) אפליקציות לתאיות מיקוד

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

הדמיה ברזולוציה סופר של תא הרוצח הטבעי החיסונית סינפסה על מישורי שומנים bilayer נתמך-זכוכית

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Immunology and Infection

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

משלוח הממברנה ממוקד על Encapsulated מטענים הידרופובי בנושאת Nanoparticle קריסטל נוזלת

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome formulation, liposomes may be preferentially taken up by different cell types in the body. This may influence the efficacy of the therapeutic particle as progression of different diseases is tissue- and cell-type-specific. In this protocol, we present one method for synthesizing and fluorescently labeling liposomes using DSPC, cholesterol, and PEG-2000 DSPE and the lipid dye DiD as a fluorescent label. This protocol also presents an approach for delivering liposomes in vivo and assessing cell-specific uptake of liposomes using flow cytometry. This approach can be used to determine the types of cells that take up liposomes and quantify the distribution and proportion of liposome-uptake across cell types and tissues. While not mentioned in this protocol, additional assays such as immunofluorescence and single-cell fluorescence imaging on a cytometer will strengthen any findings or conclusions made as they permit assessment of intracellular staining. Protocols may also need to be adapted depending on the tissue(s) of interest.

The goal of this protocol is to synthesize fluorescently-labeled liposomes and use flow cytometry to identify in vivo localization of liposomes at a cellular level.

הכנה, מתן והערכה של ספיגה תאית ספציפית לרקמת in vivo של ליפוזומים בעלי תווית צבע פלואורסצנטי

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

שימוש במבחנה לחיות תאים הדמיה כדי לחקור Chemotherapeutics מועברת על ידי חלקיקים המבוססת על שומנים בדם

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

נוהל מקיף כדי להעריך את