שמי ד"ר שנקרי נאיר, ואני פוסט-דוקטורנט באגף לביופיזיקה של קרינה במחלקה לרפואה גרעינית ב-NRF, iThemba LABS. בסרטון זה, אנו להדגים את השימוש אוטומטי Gamma H2AX מוקדי בדיקה על לימפוציטים דם היקפיים אנושיים לשימוש ביישומי סימטריה אצווה. סיכוני הקרינה לכוח אדם נשלטים בקפדנות.
קרינה מייננת משפיעה ישירות על מבנה הדנ"א על ידי גרימת שבירות דנ"א. במיוחד שבירות כפולות גדיל. אחד השלבים המוקדמים ביותר בתהליך זיהוי שבירת גדיל כפול DNA הוא זרחן של וריאנט histone, H2AX, וגיוס חלבוני תיקון.
וידאו זה יתווה את השימוש במיקרוסקופיה כדי להבקיע את מספר מוקדי גאמא-H2AX רן-גרעין באמצעות מערכת סריקת שקופיות אוטומטית ופלטפורמת ניתוח, המשלבת את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי. לימפוציטים מבודדים מדם שלם. לדלל דם שלם עם PBS ביחס של אחד לאחד, ולאחר מכן בעדינות להניח את הדם המדולל על נפח אחד של מדיום הדרגתי צפיפות.
בהדרגה שכבה את הדם על ידי החזקת הצינור מנוקד ב 45 מעלות. מעבירים את המתלים לצנטריפוגה ומסתובבים בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות ב-900 ג'י לאחר צנטריפיקציה ייווצרו ארבע שכבות. העבירו בזהירות את השכבה העכורה המכילה את הלימפוציטים לצינור חרוט סטרילי חדש.
לשטוף את הלימפוציטים עם PBS ולספור באמצעות hemocytometer. לאחר המספר הכולל של לימפוציטים נקבעים, לדלל את הלימפוציט ואת ההשעיה לריכוז של כ 800, 000 לימפוציטים במיליליטר אחד של RPMI מלא. הדגימות ומוכנות לקרינה שלנו.
הלימפוציטים מוקרנים בקרני גמא ממקור קובלט 60, ולאחר מכן מדגירים במשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס בחממה לחה של 5% פחמן דו חמצני. עבור כל מצב הקרנה או צינור, שלוש שקופיות מוכנות. מקם החלקה לתוך מחזיק הקליפ, ואחריו כרטיס המסנן, ולבסוף את המשפך.
אבטחו את קטעי השקופיות והכניסו לצנטריפוגה הציטו. מוסיפים 250 מיקרוליטרים של ההשעיה של התא על כל משפך ומסתובבים במשך 30 G במשך חמש דקות. השימוש בצנטריפוגה ציטו חיוני כדי לקבל תנאים סטנדרטיים על אוטומציה שקופיות.
לאחר סיבוב, להסיר את השקופיות מהקליפ ולאחר מכן באמצעות העט הידרופובי, לצייר עיגול סביב הנקודה שבה התאים נמצאים. כעת, לאחר שהשקופיות נוצרו, יש לתקן את התאים לשקופית כך שהכתמים האימונופלואורסצנטיים יוכלו להתרחש. התאים קבועים באמצעות 3%paraformaldehyde, או PFA, ופתרון PBS במשך 20 דקות.
לאחר קיבוע לשטוף שקופיות בצנצנת קופלין עם PBS במשך חמש דקות. לאחר מכן, לכסות את התאים עם טריטון X כדי לאפשר permeabilization. שלב permeabilization מסיר שומנים ממברנה תאית יותר כדי לאפשר נוגדנים להיכנס לגרעין התא.
מעתה והלאה, אנו משתמשים בפתרון חסימה העשוי מ- 1%BSA ב- PBS, כדי לשטוף שקופיות כדי להפחית איגודים פוטנציאליים שאינם ספציפיים. לאחר שלושה שלבי שטיפה של 10 דקות עם 1%BSA ו- PBS, השקופיות דוגרות בטמפרטורת החדר עם נוגדן H2AX עיקרי נגד גמא למשך שעה אחת בתא הלחות, מושג בקלות על ידי הוספת נייר טישו רטוב בבסיס תיבת האחסון של השקופית המלבנית. לאחר הדגירה עם נוגדן ראשוני, להטות את הנוזל ולשטוף שקופיות שוב בתמיסת 1%BSA.
דגירה שקופיות עם אחד עד אלף מדולל חמור משני נוגדן TRITC נגד עכבר במשך שעה אחת בתא לחות. הסר את הנוגדן לפני ביצוע שלוש, 10 דקות שטיפות PBS. מכסים את צנצנת קופלין בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור למשך שלבי הכביסה.
הסר את השקופיות ולנגב PBS עודף מחוץ למעגל הידרופובי עם נייר טישו ללא אבק. לבסוף, להוסיף טיפה אחת עד שתי טיפות של DAPI הביא זיכוי הרכבה בינונית בעדינות לכסות את השקופיות עם פתק הכיסוי. ודא כי אין בועות אוויר לכודות ולאחר מכן לאחסן דגימות במקום חשוך בארבע מעלות צלזיוס בן לילה.
נגב בעדינות שקופיות עם 70% אתנול והנח שקופיות על פלטפורמת הסריקה האוטומטית, או שלב השקופית, המחובר למיקרוסקופ ZED-2 של תמונות ציריות zite. בחר את הגדרת הסיווג תחת הכרטיסיה MetaCyte כדי לערוך את המסווג. המסווג שנבחר ישמש את המערכת לסריקה וציון של השקופיות, והוא מבוסס על קבוצה של פרמטרים מוגדרים מראש, אשר יקבעו כיצד המערכת בוחרת תאים ומבקיעה מוקדים.
ניתן למטב ולאמן את המסווג בהתבסס על מספר שדות תמונה מסווגים מראש. בהתאם להגדלת המיקרוסקופ, סוג הנוגדנים המשמשים להכתמה, ניתן למטב מסווג אחר. לכן מסווגים בדרך כלל משתנים ממעבדה למעבדה, אבל אנחנו ניתן סקירה של הצעדים הבסיסיים ביותר שננקטו בחשבון כאשר יש להתאים את מערך המסווג.
תחת הכרטיסיה לכידה, ניתן למצוא את המסנן שישמש, כאן DAPI ו- TRITC, עם זמן שילוב מרבי של 1.04 שניות. האחרון מבוסס על המסווג המקורי שסופק על ידי החברה ומאוחר יותר מותאם לעוצמת הנוגדנים וגמא הרקע H2AX, או אות TRITC, בסוג תא ספציפי זה, כלומר לימפוציטים. תחת הכרטיסיה חשיפה, זמן השילוב המינימלי מוגדר.
המסווג תמיד יישאר בתוך זמן האינטגרציה המינימלי והמקסימלי, מה שמונע חשיפה מוגזמת או תת-חשיפה של השקופית. תחת הכרטיסיה בחירת תאים, אזורי האובייקט המינימלי והמקסימלי הוגדרו בהתבסס על הגודל והצורה של התאים המנותחים. לדוגמה, ערך ההקמה שנקבע מראש ויחס הרוחב-גובה הם ספציפיים ללימפוציטים, אשר בדרך כלל יש צורות עגולות.
תחת הכרטיסיה תכונות, באפשרותך לשנות את תצוגת הגלריה וההיסטוגרמה, וכן לקבוע מה המיקרוסקופ צריך להבקיע. המערכת יכולה להבקיע פריטים רבים, בהתאם לתכונות שהמשתמש בחר. דוגמה לכך היא הסף של האופן שבו התוכנה מבקיעה אובייקטים בודדים.
לאחר זיהוי מסווג מתאים, בחר את ההגדרה בסרגל הצד והעניק לכל שקופית שם ייחודי, ולאחר מכן את בחירת המסווג המתאים. בחר ספירת תאים מרבית והוסף את מספר התאים המרבי הדרוש לסריקה. החיפוש מסתיים גם אם חלון החיפוש שנבחר טרם נסרק לחלוטין, ברגע שתגיע לספירת התאים המרבית.
עבור יישומי ביו-דיסימיטריה, די ניקוד אוטומטי של 1,000 תאים לשקופית, בהתחשב בכך ששלוש שקופיות לכל דגימת דם מוכנות. לחץ על אישור'כדי לאשר את ההגדרות. כדי לסרוק שקופיות, בחר חיפוש בסרגל הצד.
אם ההגדרה חלון חיפוש ידני'נבחרה בהגדרת השקופית, תיבת דו-שיח תפתח קו לקביעת אזור הסריקה. באמצעות המטרה 10 פעמים אזור החיפוש המלבני בשקופית נבחר באופן אינטראקטיבי על-ידי תיקון שתי פינות של שדה החיפוש בלחיצה השמאלית של העכבר. ניתן לאשר זאת באמצעות לחצן אישור.
כוונן מיקום התחלה של מיקוד. התוכנה תבקש מיקוד ומרכז גרעין הפניה באמצעות המטרה 40 פעמים עבור כל שקופית ולאשר הגדרות עם אישור. המערכת תעבור באופן אוטומטי לכל הצדדים ברצף. במידת הצורך, התאימו את 'הגדרת תמונה חיה' ואת זמן האינטגרציה'עבור שלב זה.
בדוק את כל הגדרות המיקרוסקופ. ודא כי הידית של צינור המיקרוסקופ נמצאת במצב שמסיט את כל האור למצלמה ולאשר את הנחיית המערכת עם אישור. המערכת מפעילה את המוקד האוטומטי של הרשת במיקום הרשת הקרוב ביותר לשדה הייחוס. הוא ממשיך להתמקד בשדה ברשת הרגילה, נע בהתפתלות לכיוון החזית והחלק האחורי של חלון החיפוש.
הסריקה מתחילה עם השלמת המוקד האוטומטי של הרשת. השלב מועבר בשדה תבנית מתפתל אחרי שדה כדי ללכוד נתונים. כאשר מזוהה תא, הוא ממוקם ותמונת גלריה מאוחסנת ומוצגת במסך וספירת התאים מתעדכנת.
החיפוש מסתיים אם החיפוש כולו נסרק, אם הגיעה ספירת התאים המרבית או אם החיפוש בוטל. לאחר השלמת הסריקה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הסרגל בתחתית ופתח דוגמה. סקור את הגלריה, המורכבת מתמונות קטנות של תאים שזוהו.
בחלון זה באפשרותך לציין את התאים המאוחסנים בגלריה באמצעות קריטריון שייבחרו מהתפריט הנפתח. תאים מוצגים בדרך כלל בסדר שבו הם זוהו. לחץ על דיאגרמת ערך תכונה של היסטוגרמה איכותית כדי לתת את ההתפלגות של התאים שזוהו, כמו גם את האמצעים, ואת סטיית התקן של מוקדי הציון.
כאן אנו משווים את האפור האפס לעומת 1.5 דוגמאות אפורות. זוהי בדרך כלל שקופית פקד, עם ערך ממוצע של 0.124 מוקדים לתא, כאשר התא לא הוקרן. בהקשר ביו-דיס-דיסמטריה, זה מצביע על כך שאדם לא נחשף לקרינה במינון גבוה.
בגרף, אנו יכולים לראות כי רוב התאים יש כמעט אפס מוקדים לתא, ואין צד של התפלגות נורמלית. כאשר אנו משווים את זה למנה של 1.5 אפור, ניתן לראות בבירור כי זוהי מדגם מוקרן. בהקשר ביו-דיס-דיסמטריה, הפצה נורמלית זו היא סימן ברור לכך שהדגימה נחשפה לקרינה.
הסריקה האוטומטית רגישה מספיק כדי לזהות מוקדים במינונים נמוכים. התוצאות מראות עלייה ליניארית ברורה של מספר המוקדים לתא עם מינון. השיטה האוטומטית של זיהוי שבירת גדיל כפול DNA שימושית עבור יישומי דיסימטריה ביולוגית מהירה וגבוהה.
תודה שצפיתם.
