私の名前はシャンカリ・ナイル博士で、私はITheMBA LABSのNRFの核医学部放射線生物物理学部門の博士研究員です。このビデオでは、バッチ対称アプリケーションでの使用のために、ヒト末梢血リンパ球に対する自動ガンマH2AX病巣アッセイの使用を示します。人員に対する放射線リスクは厳しく管理されています。
電離放射線はDNA切断を誘導することによってDNAの構造に直接影響を与えます。特に二本鎖が壊れる。DNA二本鎖破断認識プロセスの最も初期のステップの1つは、ヒストン変異体H2AXのホスホリ化と修復タンパク質の採用です。
このビデオでは、自動スライドスキャンシステムと分析プラットフォームを使用して、蛍光顕微鏡を統合して、ガンマH2AX病巣核の数をスコアリングする顕微鏡の使用について概説します。リンパ球は全血から隔離される。PBSで全血を1対1の比率で希釈し、希釈した血液を1体積の密度勾配培地にそっと置きます。
45度に傾斜したチューブを保持することによって、血液を徐々に重ねていきます。懸濁液を遠心分離機に移し、900Gで室温で20分間回転します。リンパ球を含む濁った層を新しい滅菌円錐形チューブに慎重に移す。
PBSでリンパ球を洗浄し、血球計を使用してカウントします。リンパ球の総数が決定されたら、リンパ球と懸濁液を1ミリリットルの完全RPMIで約800,000リンパ球の濃度に希釈する。サンプルと私たちの放射線の準備ができています。
リンパ球はコバルト60源からのガンマ線を照射し、その後加湿した5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で1時間インキュベートする。すべての照射条件またはチューブに対して、3つのスライドが用意されています。スライドをクリップホルダーに置き、続いてフィルターカードを置き、最後に漏斗を置きます。
スライドクリップを固定し、サイト遠心分離機に配置します。各漏斗に250マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、30Gで5分間回転させます。サイト遠心分離機の使用は、スライドの自動化に標準化された条件を取得するために不可欠です。
スピンしたら、クリップからスライドを取り出し、疎水性ペンを使用して、セルがある場所の周りに円を描きます。スライドが作成されたので、免疫蛍光染色が起こるように細胞をスライドに固定する必要があります。細胞は、3%パラホルムアルデヒド、またはPFA、および20分間のPBS溶液を使用して固定される。
固定後、PBSでコプリン瓶にスライドを5分間洗浄します。次に、細胞をトリトンXで覆い、透過性を可能にします。透過化ステップは、抗体が細胞核の内部に入ることを可能にするために、より多くの細胞膜脂質を除去する。
ここから、PBSで1%BSAで作られたブロッキング溶液を使用して、潜在的な非特異的結合を低減するためにスライドを洗浄します。1%BSAおよびPBSで10分間洗浄した後、スライドは加湿室で1〜500の一次抗ガンマH2AX抗体を用いて室温でインキュベートされ、長方形スライド貯蔵箱の基部に湿ったティッシュペーパーを加えることによって容易に達成される。一次抗体でインキュベーションした後、液体を切り落とし、1%BSA溶液でスライドを再び洗浄します。
1~1000個の希釈二次ロバ抗マウスTRITC抗体を加湿室で1時間インキュベートします。PBSで3回、10分間のスッシュを行う前に抗体を取り除きます。洗浄工程の間光にさらされるのを防ぐために、コプリン瓶をアルミホイルで覆います。
スライドを取り外し、疎水性円の外側にほこりのないティッシュペーパーで余分なPBSを拭き取ります。最後に、1~2滴のDAPIを加えて、取り付け媒体を黙認し、カバースリップでスライドをそっと覆います。閉じ込められた気泡がないことを確認し、一晩摂氏4度の暗い場所にサンプルを保存します。
70%エタノールでスライドを静かに拭き取り、ジテ軸画像ZED-2顕微鏡に取り付けられた自動スキャンプラットフォーム、またはスライドステージにスライドを配置します。[メタサイト]タブで分類設定を選択して、分類子を編集します。選択した分類子は、スライドをスキャンおよびスコア付けするためにシステムによって使用され、事前定義されたパラメータのセットに基づいて、システムがセルを選択し、フォシをスコア付けする方法を決定します。
分類器は、事前に分類された画像フィールドの数に基づいて最適化および訓練することができます。顕微鏡の倍率、染色に使用される抗体の種類や、異なる分類器を最適化することができます。したがって、分類器は一般的に実験室によって異なりますが、分類器の設定を調整する必要がある場合に考慮すべき最も基本的な手順の概要を説明します。
キャプチャータブの下には、使用されるフィルター(ここでは DAPI と TRITC)があり、最大統合時間は 1.04 秒です。後者は、同社によって提供され、後で抗体強度とバックグラウンドガンマH2AX、またはTRITCシグナル、この特定の細胞タイプ、すなわちリンパ球で調整された元の分類器に基づいています。[露出]タブで、最小統合時間が定義されます。
分類器は常に最小および最大の統合時間内に残り、スライドの過度または過少露出を防ぎます。[セルの選択]タブでは、分析されるセルのサイズと形状に基づいて、最小および最大のオブジェクト領域が定義されました。例えば、事前に決定された凹面値とアスペクト比は、一般的に丸い形を持つリンパ球に特異的である。
[特徴]タブでは、ギャラリーとヒストグラムの表示を変更したり、顕微鏡でスコアを付ける必要があるものを決定したりできます。システムは、ユーザーが選択した機能に応じて、多数の項目をスコア付けすることができます。たとえば、ソフトウェアが個々のオブジェクトにスコアを付けする方法のしきい値があります。
適切な分類子が識別されたら、サイドバーで設定を選択し、各スライドに一意の名前を付け、その後で適切な分類子を選択します。[最大セル数] を選択し、スキャンに必要なセルの最大数を追加します。選択した検索ウィンドウが完全にスキャンされていない場合でも、最大セル数に達するとすぐに検索は終了します。
バイオディスラメトリーアプリケーションでは、血液サンプルあたり3つのスライドが用意されていることを考慮して、スライドあたり1000細胞の自動スコアリングで十分です。[OK] をクリックして設定を確定します。スライドをスキャンするには、サイドバーで[検索]を選択します。
スライド設定で手動検索ウィンドウを選択した場合、スキャン領域を判別するための行がダイアログボックスに表示されます。10倍の目的を使用することにより、スライド上の長方形の検索領域は、マウスの左クリックで検索フィールドの2つのコーナーを固定することによってインタラクティブに選択されます。これはOKボタンで確認できます。
フォーカスの開始位置を調整します。ソフトウェアは、各スライドの40倍の目標を使用してフォーカスを促し、基準核を中央に配置し、OKで設定を確認します。システムは自動的に全ての辺に順番に移動します。必要に応じて、このステップでライブイメージの設定と統合時間を調整します。
すべての顕微鏡の設定を確認してください。顕微鏡チューブのレバーが、すべての光をカメラに流し込む位置に置かれ、システムのプロンプトをOKで確認します。参照フィールドに最も近いグリッド位置でグリッドの自動フォーカスが開始されます。通常のグリッドにフィールドを集中させ続け、蛇行して検索ウィンドウの前面と背面に向かって移動します。
グリッドの自動フォーカスが完了すると、スキャンが開始されます。ステージは、データをキャプチャするためにフィールドの後に蛇行パターンフィールド内で移動されます。セルが検出されると、セルの位置が示され、ギャラリーイメージが画面に保存されて表示され、セル数が更新されます。
検索全体がスキャンされた場合、最大セル数に達した場合、または検索がキャンセルされた場合、検索は終了します。スキャンが完了したら、下部のバーを右クリックしてサンプルを開きます。検出されたセルの小さな画像で構成されるギャラリーを確認します。
このウィンドウでは、ドロップダウンメニューから選択する基準を使用してギャラリーに保存されているセルを指定できます。セルは通常、検出された順に表示されます。検出されたセルの分布と平均値、および採点された病巣の標準偏差を与えるために、品質ヒストグラムまたは特徴値図をクリックします。
ここでは、グレーのゼロと 1.5 のサンプルを比較します。これは通常、コントロール スライドで、セルあたりの平均値は 0.124 foci で、セルは照射されていません。生体の非対称性の文脈では、これは人が高線量放射線にさらされないことを示すであろう。
グラフでは、細胞の大部分が細胞当たりの病巣がほぼゼロであり、正規分布の側面がないことがわかります。これを1.5グレーの用量と比較すると、これが照射されたサンプルであることがはっきりと分かる。生体の非対称性の文脈では、この正規分布は、サンプルが放射線にさらされたことを示す明確な兆候です。
自動スキャンは、低用量で病巣誘導を検出するのに十分敏感です。結果は、用量を有する細胞当たりの病巣数の明確な線形増加を示す。DNA二重鎖破断検出の自動化された方法は、高速かつ高スループットの生物学的不整合アプリケーションに有用である。
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