ניסויי NMR בלחץ גבוה לאיתור מצבים קונפורמציה נמוכים של חלבון

לחץ גבוה הוא שיטת הבחירה לשינוי האוכלוסייה היחסית של מדגם קונפורמציה חלבון. זה מאוד שימושי לבידוד ואפיון מצבים קונפורמציה אנרגיה גבוהה. בהשוואה לכל שיטות ההסתעפות, כמו pH או טמפרטורה, הלחץ של perturbation קל ליישם והפכה לחלוטין.

זהו גם הפרעה מקומית, המשפיעה בעיקר על אזורים עם חללי זכוכית או נפחים ריקים. כדי להתחיל, להציג את מדגם חנקן-15-תווית לתוך צינור זירקוניה באמצעות pipette זכוכית, ולהבטיח את המושבים מדגם בתחתית הצינור. כדי למנוע את המדגם מערבוב עם נוזל השידור, לכסות את המדגם עם 200 microliters של שמן מינרלי, ולאחר מכן למלא את שאר הצינור עם נוזל שידור.

שים טבעת O חד פעמית על גבי צינור הזירקוניה ולהחליק את הצינור לתוך הבסיס. לאחר מכן חברו את הצינור לקו הרצועה בלחץ גבוה והידקו את הבסיס לתא ביד. לאחר מכן להחיל 14.7 ניוטון מטר המומנט כדי למנוע דליפות בלחץ נמוך יותר.

כדי לבדוק את שלמות הרכבת תאי הלחץ, לחץ על הצינור עד 300 פסים מחוץ לספקטרומטר באמצעות תמיכה בתא וכלי בלימה. לאחר 15 דקות, לאפס את הלחץ לבר אחד ולבדוק דליפות עם ניגוב נקי ללא מוך. הכנס את הצינור הלא בלחץ לספקטרומטר על-ידי הנחיית קו הרצועה בזהירות.

החלק את הצינור לתוך הספקטרומטר עד שהצינור מגיע לתנוחת ישיבה לדוגמה. נעל, שים, התאם וכוון את ערוצי הפרוטיום והחנקן ושמור את ה- shims הממוטב לעתיד. הגדירו ספקטרוסקופיה ממוטבת להרפיה רוחבית עם ספקטרוסקופיה קוהרנטית חד-קוונטית הטרו והמשיכו בהקלטת ניסוי ייחוס בתנאים האטמוספריים.

הקלט סדרה של ניסויים 2D מבר אחד כדי 2.5 קילובר עבור כל 500 ברים. אם ידועים שיעורי הקיפול או ההתקפה המדויקים, לאחר כל תוספת של 500 עמודות, אפשרו לדגימה להתפרק במשך 15 עד 20 דקות. כאשר נקודת ההטיה של המעבר המתקפל או המתפתח מגיעה, תעד ניסויים נוספים כדי לשפר את דיוק ההתאמה.

פרוטוקול זה שימש כדי לחקור את תלות הלחץ של RRM2, מוטיב זיהוי הרנ"א השני ריבונוקליאופרוטאין גרעיני A1. ספקטרוסקופיה מותאמת להרפיה רוחבית עם ספקטרוסקופיית קוהרנטיות חד-קוונטית הטרוסקסואלית נאספה בבר אחד, 1.5 קילובר, שני קילובר ו-2.5 קילובר. ה- RRM2 נפתח כמעט לחלוטין בטווח של 2.5 קילו-ביבר. פרופילי עוצמת לחץ בודדים הותקנו על פי המשוואה המוצגת כאן, כדי להשיג את השינויים המתאימים באנרגיה החופשית והנפח הרגילים של גיבס הקשורים לתגובה המתפתחת.

כאשר מופה על מבנה הדומיין, שאריות עם הגודל הגדול ביותר של שינוי נפח נמצאו בתוך הליבה המבנית של הדומיין, בעוד אלה עם הגודל הקטן ביותר של שינוי נפח היו ממוקמים בעיקר בלולאות החיבור בין גדילי ביתא ו גדיל בטא לסליל מסוף C. כדי לחקור את מידת הדחיסה וההטרוגניות הקונפורמציה של הרכב המצב המקופל, נותחו השינויים הכימיים של הפרוטיום. פרופילים בודדים של משמרות כימיות פרוטיום כפונקציה של לחץ הותקנו באמצעות המשוואה המוצגת, כדי לחלץ את מקדמים ליניאריים ולא ליניאריים ספציפיים לאתר.

השאריות עם הקדם הלא ליניארי הגדול ביותר נמצאו בעיקר בליבה המבנית של התחום, בעוד שאריות עם מקדמים לא ליניאריים הקטנים ביותר היו ממוקמים בעיקר בתוך לולאות המחברות את המוטיבים המבניים השונים. חשוב להגדיר את הצינור כמו לחץ להגדיר כראוי, כדי למנוע דליפות. אם תתרחש דליפה, הגשוש כנראה יצטרך להיות מוסר כדי לנקות כל זכר של שמן מינרלי.