פרוטוקול זה לייצור וקטורים ויראליים AAV הוא חסכוני ומניב טוהר גבוה, טיטר גבוה, AAV כיתה מחקר לשימוש במודלים פרה-קליניים, בעלי חיים גדולים. טכניקה זו משתמשת בתאי HEK293 דבקים בתאי תרבית התאים, שהוא יעיל בזמן ופחות מעשי, ומאפשר פחות הפרעות לתאים. פרוטוקול זה יכול לסייע מאוד בייצור וקטור ויראלי לתחום הטיפול הגנטי, והוא יכול לשמש גם לייצור סרוטיפים אחרים של AAV שגם קושרים את הפרין סולפט.
כדי להתחיל, לאסוף תאי HEK293 מן התרבות כאשר הוא מגיע 80% השפעה. שאפו את התקשורת לפני שטפו בעדינות את צלחת תרבית התא עם שלושה מיליליטר של PBS. ואז לשאוף PBS ולהוסיף שלושה מיליליטר של טריפסין.
לדגור על הצלחות במשך שתי דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, לנטרל טריפסין, על ידי הוספת שבעה מיליליטר של DMEM מלא לצלחת, ולאסוף את supernatant ב 50 מיליליטר צינורות חרוט. הפוך בעדינות את הצינורות כדי להבטיח את התאים הומוגניים.
כדי לקבוע את צפיפות התא, לערבב 10 microliters של דגימות התא עם 10 microliters של כחול טריפן. ולהוסיף את התערובת לשקופית ספירת תאים כדי לנתח בדלפק התא. מערבבים את מתלה התא עם ליטר אחד של DMEM מלא מחומם מראש כדי לראות את תא התרבות.
סובב בעדינות את התא כדי להפיץ את התאים באופן שווה. לדגור על התא ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. בנוסף לתא תרבית התא, תאי תרבות ב 10 עד התא הרביעי לסנטימטר בריבוע בצלחת 15 ס"מ כהפניה למפגש.
לאחר 65 שעות של דגירה, כאשר התאים הם 80 עד 90% confluent, לאט להוסיף את תערובת פוליאתילנין-DNA ו- DMEM לתוך יציאת התא תרבית התא. מחלקים את הנוזל באופן שווה לכל השורות לפני הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס, ו 5% פחמן דו חמצני במשך 72 שעות. לאחר הדגירה, לנער את תא תרבית התא במרץ כדי לסלק את התאים עד שהתקשורת נראית מעוננת, ולשפוך אותו לתוך ארבעה או 500 צינורות צנטריפוגות מיליליטר.
גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 18, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. יוצקים את supernatant המובהק לתוך בקבוק PETG ליטר אחד, ו resuspend כדורי התא ב 50 מיליליטר של חוצץ מורשה בצינורות צנטריפוגות 500 מיליליטר. לדגור על הצינורות במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, צנטריפוגות הצינורות ב 18, 000 פעמים G במשך 30 דקות, ולהעביר את supernatant לאותו בקבוק PETG ליטר אחד. יש לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. להפשיר את הלסאט הגולמי בארבע מעלות צלזיוס בן לילה.
לאחר הפשרה, לסנן אותו באמצעות מסנן 0.22 מיקרון. מיד לפני צעדי הטיהור, פסיב את רכז הצנטריפוגליה על ידי הוספת ארבעה מיליליטר של מאגר טיפול מקדים מסנן עבור כל עמוד הפרין-ספרוז בשימוש. מניחים את הצינורות במשאבה פריסטרלית.
הפעל ברצף את הפתרונות והמדיה. היכונו לכרומטוגרפיה על ידי הצמדת עמוד הפרין-ספרוז חמישה מיליליטר לצינורות, והפעלת 25 מיליליטר של בזל DMEM דרך הטור. לאחר מכן לטעון 0.2 micromolar של ליסאט גולמי מסונן על העמודה בקצב זרימה של טיפה אחת עד שתיים לשנייה.
לשטוף את העמודה ברצף כדי לחמוק חמישה מיליליטר חמש פעמים עם 300 מילימולר של נתרן כלורי HBSS, עם מגנזיום וסידן, ולתייג את חמש elutions כמו E1 ל- E5. כאשר מוכן, לסובב את רכז צנטריפוגלי המכיל את חוצץ טיפול מראש ב 900 פעמים G במשך שתי דקות. זרוק את הזרימה דרך. לשטוף את מסנן רכז צנטריפוגלי עם ארבעה מיליליטר של HBSS עם מגנזיום וסידן על ידי ספינינג ב 1000 פעמים G במשך שתי דקות.
לאחר מכן מוסיפים את E2 elution לרכז צנטריפוגלי, ומסתובבים ב 1000 פעמים G במשך חמש דקות. זרוק את הזרימה דרך. באופן דומה לסובב את elution E3 לתוך רכז צנטריפוגלי עד הנגיף המרוכז הוא כמיליליטר אחד.
הסר את הנגיף המרוכז מן הרכז הצנטריפוגלי באמצעות קצה מסונן P200, ולאסוף אותו לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר. לאחר איסוף הנגיף, יש לשטוף את הרכז הצנטריפוגלי עם 200 מיקרוליטרים של HBSS עם מגנזיום וסידן. פיפטה למעלה ולמטה במרץ במשך 30 שניות כדי לנטרל כל וירוס דבק בממברנה, ולאסוף את הנגיף המרוכז באותו צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
מערבבים היטב את הצינור. לשטוף את העמודה ולהרוות עם 20% אתנול לפני אחסון בארבע מעלות צלזיוס. לאחסן את צינורות המשאבה בנתרן הידרוקסיד טוחן אחד.
יעילות התמסורת של קבסיד AAV6.2FF הושוותה בעכברים, אוגרים וכבשים במשך 28 ימים עם ניהול תוך שרירי. עכברים מנוהלים חמש פעמים 10 כדי הגנום הווקטורי ה -12 לכל קילוגרם של AAV6.2FF IgG אנושי, מבוטא בין 171 ל 237 מיקרוגרם למיליליטר של IgG אנושי בסרום. אוגר מנוהל בשתי פעמים 10 כדי הגנום הווקטורי ה -13 לקילוגרם של AAV6.2FF אנושי IgG, הביע רמות גבוהות בהרבה של IgG אנושי מאשר העכברים.
בעוד מודל בעלי החיים הגדול היה מסוגל לבטא ממוצע 35 מיקרוגרם למיליליטר של רמות IgG אנושי בפלזמה. מודלים גדולים של בעלי חיים יכולים לקבוע את הביטוי של טרנסג'ן AAV ב vivo, ולקבוע אם transgenes יש השפעה טיפולית נגד ההפרעה או המחלה של עניין. המחקר הציג לראווה את יכולת ההחלמה הגדולה של AAV6.2FF, וקטור סרוטיפ AAV 6 חדשני בשריר השלד, כמו גם את האימונוגניות הנמוכה של וקטורים ויראליים AAV ב vivo.
