הפרסום של מאמר זה היה נתמך על ידי מענק מטעם משרד המחקר של אוניברסיטת טנסי. המחברים מודים הדור הקודם של סטודנטים וחוקרים אשר עבדו כדי לחדד נהלים אלה. המחקר נתמך על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע (NSF-0851113, 0825405 ו - NSF-NSF-0550485).

1. Ultrafiltration של מי ים כדי לייצר &quot;וירוס חינם&quot; מים (וילהלם &amp; Poorvin 2001) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 20L של מי ים / lakewater נאסף כמו בסביבה נקייה מחיידקים ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים prefiltered סדרתי דרך 142 מ&quot;מ קוטר פוליקרבונט 0.8 מיקרומטר מסננים כי אפשר לשמור על -20 ° C לניתוח הקהילה. מוגדלת גודל מסננים נקבוביות ניתן להשתמש לפני שלב זה עבור מערכות פורה מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג מים ultrafiltered ממערכת Amicon M12 (Millipore) 30 kDa-הפסקת המחסנית ספירלה משמש לכלול את כל וירוסים, אפילו קטן וירוסים RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגימות מעובדים מרוכז במהירות ~ 25% עם 15-16 kPa ~ של backpressure. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדגם הנותרים של 500 מ&quot;ל מים ~ יכיל הקהילה נגיף מרוכז (אשר ניתן לשמור על ניסויים אחרים), בעוד הנותרים 19.5 ליטר של מים מווירוסים ישמש מבחני ההפקה ויראלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי יום אחד של שימוש, המערכת M12 Amicon יש לנקות כדי למנוע נזק הממברנה של מחסנית המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתה עובד עם מי ים, יש לשטוף את הממברנה עם לפחות 6L מים מילי-Q ואחריו כביסה עם פתרון NaOH 0.1N עבור 30-45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב לשטוף את המחסנית עם לפחות 6L מים מילי-Q. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום השימוש במערכת M12, מחסנית ספירלה יש לאחסן פתרון 0.05MH 3 4 ת.ד. ב 4 ° C. </li></ol> 2. הפחתת וירוס שיטת הפקה ויראלי (וילהלם et al. 2002) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עד 500 מ&quot;ל של מי ים מדגם / lakewater עם שני מארח ווירוסים מתקבל והניח ביחידה sterifilter עם 0.2-מיקרומטר הנומינלי נקבוביות גודל נמוך חלבון מחייב סינון (למשל, Durapore) הניח על זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדגם בעדינות אבק לחץ על 200 מ&quot;מ כספית &lt;בעוד הרף resuspending המדגם בעזרת פיפטה סטרילית העברת לעכב תאים חיידקיים מן להתרכז המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט שלושת הכרכים של ultrafiltrate מתווספים ההשעיה חיידקי כדי להפחית באופן משמעותי את מספר וירוסים חינם במדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק חיידקי הוא מדולל בחזרה 500 מ&quot;ל מים עם וירוסים חינם מחולק לשלושה משכפל של 150 מ&quot;ל כל ממוקמים בקבוקי 250 מ&quot;ל ברור פוליקרבונט. </li></ol> 3. תזרים משיק סינון (TFF) שיטת ייצור ויראלי (Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005) TFF מייצג גישה חלופית לשיטת הפחתת ויראלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 500 מ&quot;ל של המדגם טבעי נאסף כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם זה מרוכזת באמצעות-0.2 מיקרומטר הנומינלי נקבוביות בגודל משיק מערכת סינון לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר חלק חיידקי מצטמצם בערך 10-15 מ&quot;ל, ultrafiltered, וירוס ללא מים הוא הוסיף ומופץ לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבקבוקים לשכפל מודגרת בבית בתנאים באתרו שימוש בתאי הסביבה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמות אור משתנים תנאי השטח באמצעות הכחלחלה אקרילי אקריליק או לנקות עם הקרנת נטו לירידה בעוצמת האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמפרטורות פני השטח אמביינט מתקבלים לעתים קרובות באמצעות מי ים זורמים הסיפון חממה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות עבור הערכות שפע חיידקים ווירוסים נלקחים בזמן 0 עם ריכוז סופי של glutaraldehyde סטרילי 2.0-2.5% נוסף לתוך cryovials. דגימות אלה מיד פלאש קפוא עם חנקן נוזלי ומאוחסנים עד קפוא מעובד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם חנקן נוזלי אינו זמין, שקופיות מיקרוסקופ עשוי להיות מוכן ומעובד באופן מיידי (ראה נוהל להלן) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subsamples נאספים כל 2.5 שעות לפחות 10 שעות על ידי השיטה המתוארת לעיל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותה מים הפעם עשוי להיאסף לניתוח PCR כמותי. עד 5 מ&quot;ל של המדגם ניתן להוסיף cryovial עם סוכן לא מקבע עם הקפאת פלאש מיידית חנקן נוזלי. </li></ol></li></ol> 4. הפקה מיקרוסקופית ויראלי (נובל &amp; Fuhrman 1998, ון et al. 2004) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות קפואות להיות 0.02-מיקרומטר סינון עבור מיקרוסקופיה צריך להיות מופשר על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון המניות של SYBR הירוק על ידי דילול פתרון 1:10 המניה עם מים סטריליים. בשלב הבא, מפתרון המניות, להכין עבודה על ידי הוספת פתרון 1mL הפתרון המניות של 39 מ&quot;ל מים סטריליים. גליצרול 50%, פוספט 50% שנאגרו פתרונות מלוחים (PBS, 0.05 M Na 2 HPO 4, 0.85% NaCl, pH 7.5) ומלאי טרי פתרון 2.5% phenylenediamine-p צריך גם להיות מוכן לפני תחילת. שמור על 50% glycerol/50% פתרון PBS ב 4 ° C ו-p phenylenediamine המניה ב -20 ° C בחושך עד ההתחלה. ממש לפני הסינון מוסיפים את p-phenylenediamine של 50% PBS glycerol/50% ריכוז סופי של 0.1% כדי לשמש כפתרון Antifade. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 25 מ&quot;מ 0.02-מיקרומטר לסנן Anodisc על גבי MicronStep 0.45-מיקרומטר, מסנן גיבוי מתאית. הוספת 850 μL המדגם קבוע לחלק העליון של Anodisc ואקום ב PKA 20 עד יבש לחלוטין. 100 מקום μL הפתרון הירוק SYBR הפועלים צלחת פטרי סטרילית, עם הריק עדיין בזהירות להסיר את Anodisc ממגדל מקום לסנן על הירוק SYBR. דגירה דגימות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. בזהירות להסיר את המסנן מפתרון SYBR הירוק הפתיל האחורי של המסנן עם Kimwipe כדי להסיר את כל שאריות צבע. אם תרצה, תוכל להחזיר את המסנן למגדל ולהעביר עד 800 μL של מים מסוננים 0.02-מיקרומטר או מדיה סטרילית דרך המסנן כדי לשטוף את הכתם עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה קטנה של פתרון antifade לשקופית המיקרוסקופ במקום להחליק על גבי העטיפה. הסר את תלוש לכסות ולהוסיף את מסנן יבשים לשקופית מיקרוסקופ רטוב עם פתרון antifade. שוב, להוסיף כמות קטנה של פתרון antifade להחליק את המכסה לאט למקם אותו על גבי המסנן, מוודא להיפטר מכל הבועות כי עלול להיווצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להקפיא את השקופיות ב -20 ° C עד הצורך (אלה יש להשתמש תוך כמה חודשים כדי למנוע דהייה והוריד ספירת וירוס) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וירוסים הם המנויים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (במקרה שלנו מיקרוסקופ DMRXA לייקה) עם סט רחב מסנן כחול (אקס λ = 450-490 nm, λ = 510 nm Em עם מסנן דיכוי ב λ = 510 ננומטר). כל מסנן יהיה לפחות 20 שדות הראייה נספר, מוודא לכמת וירוסים סך מרשת כל שדה כדי להבטיח אפילו הפצה של וירוסים דרך הממברנה את המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיעור ממוצע של הישנותם וירוס משלושת עצמאית משכפל מחושבים אז סטיית התקן נקבעת שיעורי הייצור. </li></ol> 5. נציג תוצאות הנתונים הגולמיים שנאספו על ידי החוקר דורש עיבוד מתמטי מינימלי כדי לייצר שיעורי הישנותם של שפע וירוס. קבוצת הנתונים העיקרי הנובע מחקר זה היא שיעורי הישנותם של שפע וירוס ב subsamples מ incubations. תוצאות אלו בצורה עצמאית רגרסיות שפע של זמן לעומת וירוס עבור כל אחת מהדגימות. עבור כל דגימה incubations הפרט לפעול כמו טיפול אחד, אז על ידי השלמת three-לשכפל incubations החוקר יכול לחשב שיעורי כמו גם אומדן של שונות (למשל, סטיית תקן) (ראה איור 1). אזהרה אחת של תהליך זה היא כי ירידה קבועה שפע וירוס מוביל לירידה בתאי המארח במדגם כי הם שנשאו בנטל וירוס. כדי לקזז את ההפסד הזה, ספירה של שפע חיידקי ממקור שני (מי ים או מים מסוננים האגם) ו T = 0 מדגם הדגירה נחוצים. מידע זה יכול לשמש כדי להסביר את האחוז של תאים שאבדו: בהנחה כי תהליך הפחתת שפע וירוס אינה סלקטיבית בעד או נגד כל חברי הקהילה חיידקים, גורם זה יכול לשמש כדי לאמוד את קצב הפקת באתרו של וירוסים . <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. הייצור של דגימות נגיף דמוי חלקיקים מעל הדגירה של 10 שעות בבית בתנאים באתרו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. נאספו במהלך הפיטופלנקטון פריחה לחופי ניו זילנד בספטמבר 2008. <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. תרשים סכמטי של תהליך זרימת עבודה עבור ייצור assaying וירוס. התהליך מתחיל עם ultrafiltration המים מדגם ליצור וירוס ללא מים. זהו השלימה באמצעות מערכת ultrafiltration. בדגימות מים במקביל נאספים מאותו אתר ואת וירוסים חינם עברו דרך פילטר בעוד הקהילה חיידקים (המכיל תערובת של תאים נגועים ולא נגועים) נשמרת. קהילה זו היא resuspended אז במים וירוס בחינם מודגרות תחת בתנאים באתרה. שיעור הישנות של וירוסים מנוטר אז במשך 10 השעות הבאות כדי לקבוע שיעורי הייצור וירוס.

<ol>
	<li>Higgins, J. L., Kudo, I., Nishioka, J., Tsuda, A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+the+virus+community+to+a+mesoscale+iron+fertilization+in+the+sub-Arctic+Pacific+Ocean.">The response of the virus community to a mesoscale iron fertilization in the sub-Arctic Pacific Ocean.</a> Deep-Sea Res II. 56, 2788-2795 (2009).</li><li>Mioni, C. E., Poorvin, L., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+and+siderophore-mediated+transfer+of+available+Fe+between+heterotrophic+bacteria:+characterization+using+a+Fe-specific+bioreporter.">Virus and siderophore-mediated transfer of available Fe between heterotrophic bacteria: characterization using a Fe-specific bioreporter.</a> Aquat Microb Ecol. 41, 233-245 (2005).</li><li>Noble, R. T., Fuhrman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+SYBR+Green+I+for+rapid+epifluorescence+counts+of+marine+viruses+and+bacteria.">Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.</a> Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).</li><li>Parada, V., Herndl, G., Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+burst+size+of+heterotrophic+prokaryotes+in+aquatic+systems.">Viral burst size of heterotrophic prokaryotes in aquatic systems.</a> J Mar Biol Assoc U K. 86, 613-621 (2006).</li><li>Poorvin, L., Rinta-Kanto, J. M., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+release+of+Fe+and+its+bioavailability+to+marine+plankton.">Viral release of Fe and its bioavailability to marine plankton.</a> Limnol Oceanogr. 49, 1734-1741 .</li><li>Rowe, J. M., Saxton, M. A., Cottrell, M. T., DeBruyn, J. M., Berg, G. M., Kirchman, D. L., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constraints+on+virus+production+in+the+Sargasso+Sea+and+North+Atlantic.">Constraints on virus production in the Sargasso Sea and North Atlantic.</a> Aquat Microb Ecol. 52, 233-244 (2008).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+of+prokaryotic+viruses.">Ecology of prokaryotic viruses.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-181 (2004).</li><li>Weinbauer, M. G., Peduzzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency,+size+and+distribution+of+bacteriophages+in+different+marine+morphotypes.">Frequency, size and distribution of bacteriophages in different marine morphotypes.</a> Mar Ecol Prog Ser. 108, 11-20 (1994).</li><li>Weinbauer, M. G., Winter, C., H&amp;ouml, f. l. e., G, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconsidering+transmission+electron+microscopy+based+estimates+of+viral+infection+of+bacterioplankton+using+conversion+factors+derived+from+natural+communities.">Reconsidering transmission electron microscopy based estimates of viral infection of bacterioplankton using conversion factors derived from natural communities.</a> Aquat Microb Ecol. 27, 103-110 (2002).</li><li>Wen, K., Ortmann, A. C., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+estimation+of+viral+abundance+by+epifluorescence+microscopy.">Accurate estimation of viral abundance by epifluorescence microscopy.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 3862-3867 (2004).</li><li>Wilhelm, S. W., Brigden, S. M., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dilution+technique+for+the+direct+measurement+of+viral+production:+a+comparison+in+stratified+and+tidally+mixed+coastal+waters.">A dilution technique for the direct measurement of viral production: a comparison in stratified and tidally mixed coastal waters.</a> Microb Ecol. 43, 168-173 (2002).</li><li>Wilhelm, S. W., Matteson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshwater+and+marine+virioplankton:+a+brief+overview+of+commonalities+and+differences.">Freshwater and marine virioplankton: a brief overview of commonalities and differences.</a> Freshw Biol. 53, 1076-1089 (2008).</li><li>Wilhelm, S. W., Poorvin, L., Paul, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantification of algal viruses in marine samples. , 53-66 (2001).</li><li>Wilhelm, S. W., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+and+nutrient+cycles+in+the+sea.">Viruses and nutrient cycles in the sea.</a> Bioscience. 49, 781-788 (1999).</li><li>Wilhelm, S. W., Weinbauer, M. G., Suttle, C. A., Jeffrey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+sunlight+in+the+removal+and+repair+of+viruses+in+the+sea.">The role of sunlight in the removal and repair of viruses in the sea.</a> Limnol Oceanogr. 43, 586-592 (1998).</li><li>Winget, D. M., Williamson, K. E., Helton, R. R., Wommack, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+flow+diafiltration:+an+improved+technique+for+estimation+of+virioplankton+production.">Tangential flow diafiltration: an improved technique for estimation of virioplankton production.</a> Aquat Microb Ecol. 41, 221-232 (2005).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מרכיב קריטי להבנת אופן השפעת וירוסים הקהילות חיידקים ימיים היא לקבוע את הקצב שבו חלקיק הנגיף מיוצרים. בהתחשב בכך שכיחותם הם (פחות או יותר) סטטי ברוב מערכות (וילהלם &amp; Suttle 1999, Weinbauer 2004), כי וירוסים יוסרו או שניתנו לא זיהומיות במהירות במערכות מים (וילהלם et al. 1998), אז שיעורי הייצור חייב להיות יחסית מהירה כדי להחליף את חלקיקי לאיבוד. אמידת וירוסים התמותה לגרום לקהילה חיידקים דורש ידע של איך וירוסים רבים מיוצרים בכל פעם וירוס lyses תא (להלן: &quot;גודל פרץ&quot;). פרץ וירוס בגדלים בדגימות טבעי יכול להשתנות במידה רבה. גדלים Burst ניתן לקבוע באופן ישיר על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (למשל, Weinbauer &amp; Peduzzi 1994), אבל זה בדרך כלל מעבר ליכולות של מעבדה מסוימת או לא תמיד מעשי. במצבים בהם לא ניתן לקבוע באופן אמפירי, ערכים בספרות של 24 וירוסים לכל אירוע ממס ניתן להשתמש במערכות ימית 34 עבור מערכות מים מתוקים (Parada et al. 2006). אם קצב הייצור וירוס מחולק במספר הזה, התוצאה היא שפע של תאים לכל נפח נהרס על ידי וירוסים על בסיס יומי. חיידקים lysed ערך אז יכול להיות מחולק המניה עומד שפע חיידקים וכתוצאה מכך התמותה הנגרמת וירוס למערכת הנדון: קיימות ההערכות נעות בין אחוזים בודדים לאוכלוסייה כמעט כולו, ולעתים קרובות הם תלויים בגורמים אחרים במערכת הנדונה (וילהלם &amp; Matteson 2008). כדי לקבוע את שיעור התמותה הכולל מספר זה מוכפל לעתים קרובות על ידי שני (עבודה מתוך ההנחה כי 50% מכלל התאים ממשיכים להתרבות ו 50% של התאים אבדו, Weinbauer 2004). בהתחשב בכך הזמינות הביולוגית אלמנט מזין עקבות (למשל, N, P, Fe) יכול להגביל את שיעור הפריון העיקרית, וכן שטף הפחמן כאלה, דרך מערכות מים, והבנה של תפקיד התמותה מונחה וירוס חיידקים בתהליך הזה הפך לעניין geochemists ימיים. כיום קיימות מספר הערכות כי וירוסים מציע לשחרר ריכוזים משמעותיים של אלמנטים מזין בחזרה בעמודת המים על בסיס יומי (רו et al. 2008, היגינס et al. 2009) וכי מרכיבים אלה נטמעו במהירות על ידי הקהילה חיידקים (Poorvin et אל. 2004, Mioni et al. 2005). שיעור השטף מזין לסביבה ניתן לקבוע על ידי הכפלת מספר התאים נהרסו על ידי בסכום של התא לכל מזין (מסומן &quot;מכסות&quot;). מידע זה יכול לספק מרכיב קריטי להבנת איך קורי מזון מיקרוביאלי לתפקד על פני מערכות מימיים. התפתחויות שוטף: מאמצים שוטפים על ידי שורה של קבוצות מחקר כרוך בהתאמת האסטרטגיה לעיל למנות וירוסים ספציפיים בתוך הקהילה, וככזה, כדי לקבוע כיצד אורגניזמים מסוימים מושפעים פעילות הנגיף. כדי לעשות זאת החוקרים להשתמש פולימראז כמותיים תגובת שרשרת (qPCR) כדי להעריך את השפע של קבוצות וירוסים ספציפיים או משפחות במקביל האומדנים של הקהילה הכולל וירוס. התוצאות לאחר מכן ליישם ישירות לספק הערכות של תמותה וירוס, מחזור מזין, וכו &#39;עבור קבוצות ספציפיות פלנקטון. גישה חדשה זו עוצמה יאפשר לחוקרים בשנים הקרובות לחפור הרבה יותר עמוק לתוך התהליכים הקשורים באקולוגיה של וירוסים, בפעם הראשונה, לכמת את יחסי הגומלין של וירוסים לארח קהילות ספציפיות מעבר לאילוצים של מערכות מעבדה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2.5% p-phenylenediamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros</td>
<td>130575000</td>
<td>Stock for Antifade</td>
</tr>
<tr>
<td>Amicon Proflux M12 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>N/A</td>
<td>Any ultrafiltration device may be used for this step</td>
</tr>
<tr>
<td>SYBR Green I nucleic acid gel stain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-7563</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helicon S10 30kDa Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>CDUF010LT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pelicon XL filters 0.22 &mu;m</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>PXGVPPC50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GE 0.2 &mu;m PCTE membrane filters (47mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>09-732-35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>XX42LSS11</td>
<td>Other TFF systems may be used for this step</td>
</tr>
<tr>
<td>0.45 &mu;m Micronstep, Cellulosic, white plain filters (25mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>E04WP02500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GE Whatman 0.02 &mu;m Anodisc filters (25mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>68-09-6002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leica DMRXA microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any epifluorescence microscope with a blue filter set may be used</td>
</tr>
<tr>
<td>20L polycarbonate carboys</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP229-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP329-500, S640-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50% Glutaraldehyde </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>G151-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Corning 2 mL Cryovials-External Thread polypropylene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>09-761-71</td>
<td>Any cryovials may be used</td>
</tr>
<tr>
<td>Corning 5 mL Cryovials-External Thread polypropylene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>09-761-74</td>
<td>Any cryovials may be used</td>
</tr>
<tr>
<td> 85% H3PO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A242-212</td>
<td>Spiral Membrane storage</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOH pellets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>S318-3</td>
<td>M12 cleaning</td>
</tr>
<tr>
<td>Graduated Cylinders</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopore 0.8-&mu;m pore-size membrane filter (142mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ATTP14250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Millipore Stainless Steel Pressure Filter Holder (142mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>YY30 090 00</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

estimating virus production rates in aquatic systems

וירוסים הם רכיבים של מערכות מתפשט ימיים מים מתוקים, ו ידועים להיות סוכני משמעותי של תמותה של חיידקים. פיתוח אומדנים כמותיים של תהליך זה הוא קריטי כפי שאנו יכולים לפתח מודלים טובים יותר של מבנה הקהילה לתפקד חיידקים, כמו גם לקדם את הבנתנו כיצד וירוסים עובדים לשנות מחזורים biogeochemical מימיים. טכניקת ירידה וירוס מאפשר לחוקרים להעריך את הקצב שבו חלקיקי הנגיף משתחררים מן הקהילה חיידקים אנדמיים. בקיצור, שפע (תאית) וירוסים חינם מצטמצם במדגם בעוד הקהילה חיידקים נשמר ריכוז הסביבה הקרובה. הקהילה מיקרוביאלי הוא מודגרות אז בהיעדר של וירוסים חינם בקצב שבו וירוסים כמוה במדגם (דרך תמוגה של חברי כבר נגוע של הקהילה) ניתן לכמת באמצעות מיקרוסקופיה epifluorescence או, במקרה של וירוסים ספציפיים, כמותי PCR. שיעורים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להעריך את שיעור התמותה עקב חיידקים תמוגה וירוס בתיווך התא.

Watch this Scientific Journal Video about Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems at JoVE.com

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

שיעור התחלופה של וירוסים במערכות ימיים מים מתוקים ניתן לאמוד על ידי ירידה וטכניקה הישנותם. הנתונים לאפשר לחוקרים להסיק ששיעורי התמותה וירוס בתיווך של חיידקים במערכות מים.

הערכת הפקה חליפין וירוס במערכות Aquatic

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

estimating-virus-production-rates-in-aquatic-systems

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.5K Views.  University of Tennessee. שיעור התחלופה של וירוסים במערכות ימיים מים מתוקים ניתן לאמוד על ידי ירידה וטכניקה הישנותם. הנתונים לאפשר לחוקרים להסיק ששיעורי התמותה וירוס בתיווך של חיידקים במערכות מים.

Video: Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

ייצור יעיל Parvovirus רקומביננטי בעזרת adenovirus הנגזרות מערכות

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

איתור vivo מערכות הדמיה (IVIS) של וירוס אנצפליטים נוירו פולשנית

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

זיהוי של קידוד ללא קידוד RNA מחלקות לידי ביטוי החזירים דם מלא

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

מדידה של שיעורי הטעויות הספציפיים של פטרת מערכות כתבת

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...