הפרוטוקול מספק הליך פשוט כדי להפוך ניסויי FRET על ידי פליטות רגישות יותר לשחזור ודומה. היתרון העיקרי של FRET הם מדידות בזמן אמת, כך שניתן לטפל בתהליכים דינמיים. להתאמת לייזר באמצעות פוטומולטילייה של שידור, הנח את השקופית בת שמונה הבאר המכילה את הפרוטופלסטים המודבקים מתחת למיקרוסקופ.
לאחר בחירת באר ריקה, בחר מצב סריקת קו ותצוגת היסטוגרמה, הקטן את עוצמת הלייזר למינימום והתאם את רווח הגלאי לרעשי רקע הניתנים לזיהוי. לאחר מכן, להגדיל את עוצמת הלייזר בשלבים של 0.5% תוך הקלטת האות המתאים. להתאמת לייזר באמצעות המצב המשקף, בחרו באר ריקה ולאחר מכן החל מסנן השתקפות.
התחל את מצב ההשתקפות וודא שטווח גל הגל של הגלאי מכסה את אורך הגל של הלייזר. בחר את מצב סריקת הקו ואת תצוגת היסטוגרמה, הקטן את עוצמת הלייזר למינימום והתאם את רווח הגלאי לרעשי רקע הניתנים לזיהוי. לאחר מכן, הזז את המטרה למיקום הנמוך ביותר לפני הזזתה בחזרה למעלה עד להשתקפות של כיסוי נראה, ולאחר מכן להגדיל את עוצמת הלייזר בשלבים של 0.5% תוך הקלטת האות המתאים.
להערכת נתונים, סמן ומיין את הנתונים לפי עוצמות האות, ולאחר מכן התווה את עוצמת האות כנגד כוח הלייזר היחסי ובחר בעוצמות הלייזר וכתוצאה מכך עוצמת אות דומה. להתאמת הפוטמוליפליירים, בחרו באר ריקה והחלו מסנן השתקפות, עברו למצב השתקפות וודאו שטווח אורך הגל של הגלאי מכסה את אורך הגל של הלייזר. בחר את מצב סריקת הקו ואת תצוגת היסטוגרמה, הקטן את רווח הגלאי לחצי מהמקסימום והתאם את עוצמת הלייזר לרעשי רקע הניתנים לזיהוי.
לאחר מכן, הזז את המטרה למיקום הנמוך ביותר לפני הזזתה בחזרה למעלה עד להשתקפות של כיסוי גלוי, ולאחר מכן להגדיל את רווח הגלאי ב 50 עד 100 צעדים וולט ולתעד את האות המתאים. להערכת נתונים, התווו את העוצמה כנגד רווח הגלאי עבור כל גלאי, ולאחר מכן בחרו את רווחי הגלאי הבודדים כדי לקבל רגישות דומה. לרכישת תמונות, בחר את המסננים המתאימים או המראות הדיכרואיות והשתמש באותה מראה דיכרואית עבור כל הערוצים כדי לאפשר סריקה שורה אחר שורה, ולאחר מכן בחר יעד טבילת מים להדמיה של תאים חיים ובחר סריקה של 12 או 16 סיביות במהירות סריקה מתונה.
לאחר מכן, הגדר את טווח הזיהוי רצוי 470 עד 510 ננומטר לזיהוי תורם ו 530 עד 600 ננומטר לגילוי קבל במקרה של זוג FRET של חלבון פלואורסצנטי ציאן משופר או ECFP וחלבון פלואורסצנטי צהוב משופר או EYFP. לאחר החלת הגדרות הגלאי והלייזר כפי שהודגם בעבר, תקן את עוצמת הלייזר בהתבסס על שולחן כוח הלייזר שהושג במידת הצורך. ודא שיחס האות לרעש מכסה את כל הטווח הדינמי של הגלאים.
לאחר כוונון עדין עם קוטר חור הסיכה תוך שמירה על עוצמות הלייזר והגלאי מקבל קבוע, בצע את מדידות FRET לוקח תמונות של לפחות 20 תאים. כדי לקבוע את תיקוני ההצלבה, בצע מדידות FRET עם תאים המבטאים את פלואורופור התורם בלבד ואלה המבטאים את פלואורופור הקבלה בלבד. לכיול המדידות, בצע מדידות FRET עם תאים המבטאים את היתוך מקבל התורם.
להערכת נתונים, השג פרופילי שורות של התאים המבטיחים שכל פרופיל מכיל לא יותר מתא אחד. שמור את הפרופילים כקבצי טקסט. לאחר מכן, באמצעות אפשרות ייבוא קובץ טקסט במקטע הנתונים, יבא את קבצי הטקסט לגיליון אלקטרוני.
לאחר מכן, קרא את הערכים המרביים על-ידי החלת הפונקציה max ולאחר מכן פרט את הערכים המתקבלים בטבלה בעלת עמודה כל אחד עבור מזהה פליטת תורמים, פליטת FRET IF, IA של פליטת מקבלים, ולפחות ארבע ערכות נתונים, תורם בלבד, מקבל בלבד, היתוך ומקבל תורם ומדידה. התאמת הלייזר חשפה עלייה ליניארית בפליטה עם עוצמת לייזר גוברת. כפי שניתן לראות במדרון תלול יותר, פליטת קו 514 ננומטר הייתה גבוהה בהרבה מפליטת קו 458 ננומטר.
שינוי רווחי הגלאי בכוח לייזר מתמיד חשף התנהגות מעריכית עבור שני הגלאים המנותחים. הפער והדימום הספקטרלי של התורם והמקבל שניתחו עם חלבונים מטוהרים רקומביננטיים וזה ניתח עם תאים המבטאים חלבונים אלה ממחיש כי אי אפשר להשמיט את הקביעה של דימום ספקטרלי דרך בתאים חיים שנגרם ככל הנראה על ידי פיגמנטים תאיים. יעילות FRET בין תת-אוניות ה-ATPA vacuolar שכותרתן, VHA AECFP ו- VHA AEYFP ירדה עם עוצמת האות הגוברת.
לעומת זאת, האינטראקציה בין VHA E1 ECFP ו- VHA CEYFP לא הייתה תלויה בעוצמת האות. הבחירה ברכיבים אופטיים מתאימים חיונית לאיתור התורם והמקבל. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם עבור חיישנים רצומטריים בתאים חיים כדי להגדיל את הרבייה בניסויים אלה.
