ويوفر البروتوكول إجراء بسيطا لجعل تجارب FRET عن طريق الانبعاثات الحساسة أكثر قابلية للاستنساخ وقابلية للمقارنة. الميزة الرئيسية ل FRET هي القياسات في الوقت الحقيقي بحيث يمكن معالجة العمليات الديناميكية. لتعديل الليزر باستخدام فوتوموليبلييه الإرسال، ضع الشريحة ثمانية جيدا التي تحتوي على البروتوبلاستات المصابة تحت المجهر.
بعد اختيار بئر فارغة، اختر وضع مسح الخط وعرض الرسم البياني، وخفض كثافة الليزر إلى الحد الأدنى وضبط كسب كاشف للضوضاء الخلفية للكشف. بعد ذلك، قم بزيادة كثافة الليزر في خطوات 0.5٪ أثناء تسجيل الإشارة المقابلة. لتعديل الليزر باستخدام الوضع العاكس، حدد بئرا فارغا، ثم قم بتطبيق فلتر انعكاس.
قم بتشغيل وضع الانعكاس وتأكد من أن نطاق الطول الموجي للكاشف يغطي الطول الموجي لليزر. اختر وضع مسح الخط وعرض الرسم البياني، وتقلل كثافة الليزر إلى الحد الأدنى، وضبط كسب الكاشف للضوضاء الخلفية القابلة للكشف. بعد ذلك، قم بتحريك الهدف إلى الموضع الأدنى قبل تحريكه مرة أخرى حتى يظهر انعكاس الغطاء، ثم قم بزيادة كثافة الليزر في خطوات 0.5٪ أثناء تسجيل الإشارة المقابلة.
لتقييم البيانات، قم بجدولة البيانات وفرزها حسب كثافة الإشارة، ثم رسم كثافة الإشارة مقابل قوة الليزر النسبية واختر كثافة الليزر مما يؤدي إلى كثافة إشارة مماثلة. لتعديل الأجهزة الضوئية، حدد بئرا فارغا وطبق فلتر الانعكاس، وبدل وضع الانعكاس وتأكد من أن نطاق الطول الموجي للكاشف يغطي الطول الموجي لليزر. اختر وضع مسح الخط وعرض الرسم البياني، وتقلل من كسب الكاشف إلى نصف الحد الأقصى وضبط كثافة الليزر للضوضاء الخلفية القابلة للكشف.
بعد ذلك، قم بتحريك الهدف إلى أدنى موضع قبل تحريكه مرة أخرى حتى يظهر انعكاس الغطاء، ثم قم بزيادة كسب الكاشف في خطوات 50 إلى 100 فولت وسجل الإشارة المقابلة. لتقييم البيانات، رسم كثافة ضد كسب كاشف لكل كاشف، ثم اختيار مكاسب كاشف الفردية للحصول على حساسية مماثلة. للحصول على الصورة، اختر المرشحات المناسبة أو المرايا الديكهروية واستخدم نفس المرآة الديكهروبية لجميع القنوات لتمكين المسح الضوئي سطرا سطرا، ثم حدد هدف غمر الماء لتصوير الخلايا الحية واختر المسح الضوئي 12 أو 16 بت بسرعة مسح معتدلة.
بعد ذلك، حدد نطاق الكشف ويفضل أن يكون 470 إلى 510 نانومتر للكشف عن المانحين و 530 إلى 600 نانومتر للكشف عن المقبول في حالة زوج FRET من بروتين فلوري سماوي معزز أو ECFP وبروتين فلوري أصفر محسن أو EYFP. بعد تطبيق إعدادات الكاشف والليزر كما هو موضح سابقا، راجع كثافة الليزر استنادا إلى جدول طاقة الليزر الذي تم الحصول عليه إذا لزم الأمر. تأكد من أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء تغطي النطاق الديناميكي الكامل للكاشفات.
بعد ضبط دقيق مع قطر الثقب مع الحفاظ على كثافة الليزر والمكاسب كاشف ثابت، وإجراء قياسات FRET التقاط صور من 20 خلية على الأقل. لتحديد التصحيحات عبر الحديث، قم بإجراء قياسات FRET مع الخلايا التي تعبر عن الفلوروفور المانح فقط وتلك التي تعبر عن فلورفور المقبول فقط. لمعايرة القياسات، قم بإجراء قياسات FRET مع الخلايا التي تعبر عن اندماج المتقبل المانح.
لتقييم البيانات، الحصول على التشكيلات الجانبية سطر من الخلايا التأكد من أن كل ملف تعريف يحتوي على خلية واحدة لا يزيد عن. حفظ ملفات التعريف كملفات نصية. ثم باستخدام خيار استيراد الملف النصي في قسم البيانات، قم باستيراد الملفات النصية إلى جدول بيانات.
بعد ذلك، اقرأ القيم القصوى من خلال تطبيق الوظيفة القصوى، ثم قم بإدراج القيم التي تم الحصول عليها في جدول يحتوي كل عمود على معرف الانبعاثات المانح، و FRET EMISSION IF، وIA للانبعاثات المقبولة، وما لا يقل عن أربع مجموعات بيانات، المانح فقط، المقبول فقط، اندماج المانحين المقبول، والقياس. وكشف تعديل الليزر عن زيادة خطية في الانبعاثات مع زيادة كثافة الليزر. وكما يتضح من منحدر أكثر انحدارا، فإن انبعاث خط 514 نانومتر كان أعلى بكثير من انبعاث خط 458 نانومتر.
وكشفت متفاوتة مكاسب كاشف في قوة الليزر المستمر سلوك الأسي لكلا كاشفات تحليلها. التناقض والنزيف الطيفي من خلال المتبرع والمقبل تحليلها مع البروتينات النقية المؤتلفة، وأن تحليلها مع الخلايا التي تعبر عن تلك البروتينات يدل على أنه من المستحيل حذف تحديد النزيف الطيفي من خلال في الخلايا الحية التي يحتمل أن تسببها أصباغ الخلوية. انخفضت كفاءة FRET بين الوحدات الفرعية VACUolar ATPA المسماة ، VHA AECFP ، و VHA AEYFP مع زيادة كثافة الإشارة.
وعلى النقيض من ذلك، كان التفاعل بين VHA E1 ECFP وVHA CEYFP مستقلا عن كثافة الإشارة. اختيار المكونات البصرية المناسبة أمر بالغ الأهمية للكشف عن المتبرع والمقبل. ويمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول لأجهزة الاستشعار نسبة في الخلايا الحية لزيادة استنساخ في هذه التجارب.
