이 프로토콜은 민감하게 반응된 배출에 의한 FRET 실험을 보다 재현가능하고 비교할 수 있도록 하는 간단한 절차를 제공합니다. FRET의 주요 장점은 동적 프로세스를 해결할 수 있도록 실시간으로 측정됩니다. 전송 광증을 사용하여 레이저 조정을 위해, 현미경 의 밑에 전염된 프톱서를 포함하는 8웰 슬라이드를 놓습니다.
빈 우물을 선택한 후 라인 스캐닝 모드와 히스토그램 뷰를 선택하고 레이저 강도를 최소화하고 검출기 게인을 감지 가능한 배경 잡음으로 조정합니다. 다음으로, 해당 신호를 기록하는 동안 0.5 %의 단계에서 레이저 강도를 증가시다. 반사 모드를 사용하여 레이저 조정을 위해 빈 우물을 선택한 다음 반사 필터를 적용합니다.
반사 모드를 전환하고 검출기 파장 범위가 레이저의 파장을 커버하도록 합니다. 라인 스캐닝 모드와 히스토그램 뷰를 선택하고 레이저 강도를 최소화하고 검출기 게인을 감지 가능한 배경 소음으로 조정합니다. 다음으로, 커버슬립의 반사가 보일 때까지 다시 이동하기 전에 목표를 가장 낮은 위치로 이동한 다음 해당 신호를 기록하는 동안 0.5%의 단계로 레이저 강도를 증가시게 한다.
데이터 평가를 위해 신호 강도에 의해 데이터를 타부레이팅및 정렬한 다음 상대 레이저 전력에 대한 신호 강도를 플롯하고 레이저 강도가 유사한 신호 강도를 선택합니다. 광증의 조정을 위해 빈 우물을 선택하고 반사 필터를 적용하고 반사 모드로 전환하고 검출기 파장 범위가 레이저의 파장을 커버하도록 합니다. 라인 스캐닝 모드와 히스토그램 뷰를 선택하고 검출기 게인을 최대절반으로 줄이고 레이저 강도를 감지가능한 배경 잡음으로 조정합니다.
다음으로, 커버슬립의 반사가 보일 때까지 다시 이동하기 전에 목표를 가장 낮은 위치로 이동한 다음 검출기 게인을 50~100볼트 단계로 늘리고 해당 신호를 기록합니다. 데이터 평가의 경우 각 검출기에 대한 검출기 게인에 대한 강도를 플롯한 다음 개별 검출기 이득을 선택하여 유사한 감도를 얻습니다. 이미지 수집의 경우 적절한 필터 또는 이색 거울을 선택하고 모든 채널에 동일한 이색 거울을 사용하여 라인 스캐닝별로 라인을 활성화한 다음 라이브 셀 이미징을 위한 수분 침지 목표를 선택하고 적당한 스캐닝 속도로 12 비트 스캐닝을 선택합니다.
다음으로, 기증자 검출을 위한 검출 범위를 470 내지 510 나노미터, 향상된 시안 형광 단백질 또는 ECFP의 FRET 쌍의 경우 수용자 검출을 위한 530 내지 600 나노미터를 정의하고 향상된 황형 광단백질 또는 EYFP를 정의한다. 이전에 설명한 바와 같이 검출기 및 레이저 설정을 적용한 후 필요한 경우 얻어진 레이저 파워 테이블을 기반으로 레이저 강도를 수정합니다. 신호 대 잡음 비율이 검출기의 전체 동적 범위를 커버하도록 합니다.
레이저 강도와 검출기를 일정하게 유지하면서 핀홀 직경으로 미세 조정한 후, 최소 20개의 셀의 이미지를 촬영하는 FRET 측정을 수행합니다. 크로스토크 보정을 결정하기 위해, 기증자 플루오로포어만 을 표현하는 세포와 수용자 형광소만 을 표현하는 세포로 FRET 측정을 수행한다. 측정의 교정을 위해, 기증자 수용자 융합을 표현하는 세포로 FRET 측정을 수행합니다.
데이터 평가의 경우 각 프로파일에 두 개 이상의 셀이 포함되어 있지 않도록 셀의 선 프로파일을 가져옵니다. 프로필을 텍스트 파일로 저장합니다. 그런 다음 데이터 섹션의 텍스트 파일 가져오기 옵션을 사용하여 텍스트 파일을 스프레드시트로 가져옵니다.
다음으로 최대 함수를 적용하여 최대 값을 읽은 다음 기증자 배출 ID, FRET 배출 IF, 수락자 방출 IA 및 최소 4개의 데이터 세트, 기부자 전용, 기부자 수용자 융합 및 측정에 대한 열을 갖는 테이블에 얻은 값을 나열합니다. 레이저 조정은 레이저 강도가 증가함에 따라 방출의 선형 증가를 밝혀냈습니다. 가파른 경사면에 의해 도시된 바와 같이, 514 나노미터 선의 방출은 458 나노미터 라인의 방출보다 훨씬 높았다.
일정한 레이저 전력에서 검출기 이득을 변화면 분석된 두 검출기 모두에 대한 기하급수적 동작이 밝혀졌습니다. 기증자와 수용자의 불일치 및 스펙트럼 출혈-스루-스루는 재조합 정제 단백질로 분석되고 그 단백질을 표현하는 세포로 분석된 것은 세포 안료로 인한 살아있는 세포에서 스펙트럼 출혈의 결정을 생략하는 것이 불가능하다는 것을 보여줍니다. 라벨이 부착된 바쿠올라 ATPA 서브유닛, VHA AECFP 및 VHA AEYFP 간의 FRET 효율은 신호 강도증가로 감소했습니다.
대조적으로, VHA E1 ECFP와 VHA CEYFP 사이의 상호 작용은 신호 강도와 독립적이었습니다. 적절한 광학 부품의 선택은 기증자와 수용자의 검출에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 또한 이러한 실험에서 재현성을 높이기 위해 살아있는 세포에서 비율 메트릭 센서를 적용할 수 있습니다.
