פרוטוקול זה מספק ניתוח בזמן אמת של שני מסלולים ביו-אנרגטיים עיקריים: נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזה ברקמות רשתית עכבר ex vivo ניתחו זה עתה. ניתוח סוסוני הים המסורתי התמקד בתאים חד-שכבתיים מתורבתים, בעוד פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור פעילות מיטוכונדריאלית ברקמות שזה עתה נותחו, במיוחד ברשתית. טכניקה זו משמשת לחקר הפעילויות של המיטוכונדריה ודגלי הגליקוליזיס ברשתיות של דגמי עכבר ניוון רשתית תורשתית.
זהו כלי שימושי לחקר הרשתית ויש לו גם פוטנציאל להיות מיושם על סוג אחר של רקמה לפתח טיפולים פוטנציאליים. החלק הקשה ביותר בפרוטוקול זה הוא להשיג דיסקי ניקוב איכותיים רשתית עכבר ניתחו זה עתה, ולכן מומלץ כי לאדם שיבצע טכניקה זו יש כישורים טובים לנתח רשתית. יום לפני הניסוי, פתח את קלטת מחסנית החיישן והוסף מיליליטר אחד של מדיום כיול לכל באר של צלחת השירות.
דגירה לילה באינקובטור ללא פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס כדי להפעיל את הפלורופורים. ביום הניסוי, להכין בינוני אסאי בתרופות מורכבות לדלל מהמלאי. לחמם את בינוני אסאי באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
הגדר את תוכנית ההסמכה על המכונה כמתואר בכתב היד של הטקסט. פתח את המכסה של הקלטת המכילה תוספות רשת. Pipette שמונה מיקרוליטרים של תערובת הציפוי לכל תוספת רשת, ולאחר מכן להשתמש קצה פיפטה כדי להפיץ בעדינות את הטיפה סביב כדי להפיץ את תערובת הציפוי באופן שווה לאורך כל תוספת הרשת.
סוגרים את הקלטת ומאפשרים לתוספות הרשת לדגור בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות לפחות לספיגה. לאחר הדגירה, לשטוף את תוספות רשת על ידי pipetting ארבעה מיליליטר של בינוני assay ישירות על תוספות. יש לנער בעדינות את הקלטת כדי להבטיח שכל התוספות של הרשת נשטפות עם מדיום ה-assay.
כדי להכין את אגרוף הרשתית, להסית את העיניים מעכבר מורדם מבוגר ולהניח אותם לתוך PBS קר כקרח בצלחת פטרי, ולאחר מכן למקם את צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ ניתוח. באמצעות מיקרו-סיקורס, חותכים את עצב הראייה, ואז מסירים בזהירות את שרירי ההזרמה המחוברים מחוץ לגלגל העין. באמצעות מחט 30 מד, ניקוב חור בקצה הקרנית.
לאחר מכן השתמש microscissors ביתור עדין כדי להפוך חתך מעגלי לאורך קצה הקרנית. בעזרת מלקחיים חדים, הסירו את הקרנית, העדשה ואת ההומור הזגג מכוס העין. לעשות כמה חתכים קטנים על השכבה scleral בקצה של העין באמצעות microscissors ניתוח עדין.
השתמש בשני מלקחיים חדים כדי להחזיק את הרקמה הסקלרלית בכל צד ולמשוך את השכבה הסקלרלית בזהירות רבה כדי להסיר אותו מהרשתית העצבית. חזור על זה סביב העין עד שכל sclera מוסר רשתית שלמה מתקבלת. לעשות חתכים רדיאליים על הרשתית כדי לשטח אותו וליצור כמה חלקים נפרדים באמצעות microscissors ניתוח.
לאחר מכן, באמצעות אגרוף ביופסיה בקוטר מילימטר אחד, לחתוך דיסק רשתית אחד מכל קטע של הרשתית שטוחה. אגרוף במרחק שווה מראש עצב הראייה. מעבירים את התוספות של רשת מצופה מראש לצלחת הפטרי המנוצלת באמצעות מלקחיים.
בעזרת שתי מברשות ריסים עדינות במיוחד, הניחו את דיסק ניקוב הרשתית במרכז הכנס הרשת כשצד שכבת תא הגנגליון כלפי מטה נוגע ברשת ובשכבת הפוטורה-קולטור הפונה כלפי מעלה. כדי לטעון את מחסנית החיישן, הוציא את קלטת מחסנית החיישן הלחות מתוך החממה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת כיסוי המאיץ הידרו, למקם את מחסנית החיישן בחזרה על צלחת השירות.
טען את הנפח הרצוי של פתרונות הזרקה מורכבים ליציאות מתאימות על ידי החזקת קצה הפיפטה בזווית של 45 מעלות, החדרת קצה הפיפטה באמצע הדרך ליציאת הזרקה עם שיפוע הקצה כנגד הקיר הנגדי של יציאת ההזרקה. טענו בעדינות את התרכובת לכל יציאה. טען את מחסנית החיישן למחשב לכיול על-ידי לחיצה על לחצן התחל הפעלה כדי לפתוח את מגש המחשב.
מקם את מחסנית החיישן במכונה ולחץ על לחצן אני מוכן להתחיל בכיול. טען את הנפח הרצוי של מדיום ה- assay לכל באר של צלחת לכידת האי. בעזרת מלקחיים, תפוס את שפת הכנס הרשת המכיל דיסקים של פונץ' רשתית והוציא אותה מצלחת הפטרי.
הקש קלות על החלק התחתון של רשת להוסיף על רקמת לנגב סופג כדי להסיר נוזל נוסף ולשים אותו לתוך הבאר של צלחת לכידת האי. חזור על שלב זה עד שכל התוספות של רשת עם אגרופים ברשתית ממוקמות בצלחת לכידת האי הממלאת את בארות תיקון הרקע ובארות ריקות עם תוספות רשת ריקות. באמצעות שני מלקחיים של גראף, לחץ על שפת כל רשת מוכנסת בזהירות ובעדינות, וודא שהן מוכנסות בבטחה בתחתית צלחת לכידת האי.
מניחים את צלחת לכידת האי הטעון לתוך חממת צלזיוס 37 מעלות במשך חמש דקות כדי להתחמם, ולאחר מכן להוציא את צלחת השירות לאחר הכיול הושלם. החלף אותו בצלחת לכידת האי המכילה אגרופים ברשתית וחדש את ההפעלה של ה- assay על ידי לחיצה על לחצן צלחת תא העומס. לאחר השלמת ההפעלה, הופלט את מחסנית החיישן ואת צלחת לכידת האי המכילה אגרופים ברשתית על-ידי לחיצה על לחצן הופלט ולאחר מכן לחץ על לחצן סיום כך שהנתונים יישמרו באופן אוטומטי כקובץ ASYR והמסך ישתנו באופן אוטומטי כדי לקבל את תצוגת התוצאות.
בדיקות הלחץ המיטוכונדריאליות המציגות עקבות זיהוי התווים האופטי (OCR) ובוחן קצב הגליקוליטי המציג גם מעקב OCR וגם מעקב ECAR בוצעו באמצעות דיסקים של ניקוב רשתית מילימטר אחד. ב בדיקת הלחץ המיטוכונדריאלי, Bam15 הוזרק כדי לשחרר שיפוע פרוטונים מייצור ATP מיטוכונדריאלי, וכתוצאה מכך את העלייה של OCR לרמה מקסימלית. רוטנון ואנטי-מיצין A הוזרקו כדי לעכב את הנשימה המיטוכונדריה במתחם אחד ומורכב שלוש בהתאמה, וכתוצאה מכך ירידה ב- OCR לרמה המינימלית.
ההבדל בין הרמה המקסימלית של זיהוי OCR לבין המדידה האחרונה של רמת זיהוי האופטי האופטי (OCR) המבססת משקף את יכולת העתודה המיטוכונדריאלית. בהתבוננות בקצב הגליקוליטי, הזרקת רוטנון ואנטי-מיצין A משביתה את הנשימה המיטוכונדריאלית ומעלה. גליקוליזה נתפסת על ידי הזרקת 2-deoxy-d-גלוקוז, אשר מתחרה גלוקוז עבור עקדת hexokinase, גורם ECAR לרדת לרמה המינימלית.
ההבדל בין הרמה המקסימלית של Glyco ECAR במידה האחרונה של רמת הבזל של Glyco ECAR משקף את קיבולת עתודת הגליקוליזיס. כדי להפיק נתונים אמינים, חשוב להשיג איכות טובה של דיסקי ניקוב רשתית ולהגביל את זמן הניתוח הכולל תוך שעה וחצי. לאחר הניסוי, ניתן לכמת את הדנ"א של תכולת החלבון של דיסק רשתית בבאר ולהשתמש בו כדי לנרמל את נתוני סוסון הים.
אז פרוטוקול זה נוצל כדי ללמוד פיתוח, הזדקנות, ומחלות ברשתית. העדפת רקמות או הסתמכות על מצעים שונים דלק כגון גלוקוז או חומצות שומן נותח גם.
