Bu protokol, iki ana biyoenergetik yolun gerçek zamanlı analizini sağlar: mitokondriyal solunum ve yeni parçalanmış ex vivo fare retina dokularında glikoliz. Geleneksel denizatı analizi kültürlü monolayered hücrelere odaklanırken, bu protokol araştırmacıların taze parçalanmış dokulardaki mitokondriyal aktiviteyi, özellikle retinayı incelemelerini sağlar. Bu teknik, kalıtsal retina dejenerasyon fare modellerinin retinalarındaki mitokondrilerin faaliyetlerini ve glikoliz bayraklarını incelemek için kullanılır.
Retina araştırmalarına yararlı bir araçtır ve ayrıca potansiyel tedaviler geliştirmek için diğer doku türlerine uygulanma potansiyeline sahiptir. Bu protokolün en zor kısmı, taze parçalanmış fare retinasından kaliteli zımba diskleri elde etmektir, bu nedenle bu tekniği gerçekleştirecek bireyin iyi retina diseksiyon becerilerine sahip olması önerilir. Denemeden bir gün önce sensör kartuş kasetini açın ve şebeke plakasının her kuyusuna bir mililitre kalibrasyon ortamı ekleyin.
Floroforları harekete geçirmek için 37 santigrat derecede karbondioksitsiz bir inkübatörde bir gecede kuluçkaya yatırın. Deney günü, stoktan seyreltilmiş bileşik ilaçlarda tahlil ortamı hazırlayın. 37 santigrat derece su banyosunda tahlil ortamını ısıtın.
Metin el yazmasında açıklandığı gibi makinede tahlil programını ayarlayın. Kafes uçları içeren kasetin kapağını açın. Pipet her örgü kesici uç için kaplama karışımının sekiz mikrolitresi, daha sonra kaplama karışımını örgü kesici ucun her yerine eşit olarak dağıtmak için damlacığı hafifçe etrafa yaymak için bir pipet ucu kullanın.
Kaseti kapatın ve ağ uçlarının emilim için oda sıcaklığında en az 25 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. Kuluçkadan sonra, tahlil ortamının dört mililitresini doğrudan kesici uçların üzerine pipetleyerek ağ uçlarını yıkayın. Tüm örgü uçlarının tahlil ortamıyla yıkanmasını sağlamak için kaseti hafifçe sallayın.
Retina yumruğu hazırlamak için, yetişkin bir ötenazi faresinden gözleri enucleate ve bir Petri kabında buz gibi soğuk PBS içine yerleştirin, sonra Petri kabını bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Mikroscisörleri kullanarak optik siniri kesin, ardından göz küresinin dışına takılan ekstrarectus kaslarını dikkatlice çıkarın. 30 kalibrelik bir iğne kullanarak korneanın kenarında bir delik açın.
Daha sonra korneanın kenarı boyunca dairesel bir kesim yapmak için ince diseksiyon mikrossörleri kullanın. Keskin diseksiyonaps kullanarak korneayı, lensi ve vitreus mizahını göz kabından çıkarın. İnce diseksiyon mikrossörleri kullanarak göz kabının kenarındaki skleral tabaka üzerinde birkaç küçük kesim yapın.
Her iki taraftaki skleral dokuya tutunmak için iki keskin diseksiyon tokparlaması kullanın ve nöral retinadan çıkarmak için skleral tabakayı çok dikkatli bir şekilde çekin. Tüm sklera çıkarılana ve sağlam bir retina kabı elde edilene kadar bunu göz kabının etrafında tekrarlayın. Retina kabını düzleştirmek için radyal kesikler yapın ve diseksiyon mikrossörleri kullanarak birkaç farklı bölüm oluşturun.
Daha sonra, bir milimetre çapında biyopsi zımbalayıcı kullanarak, düzleştirilmiş retina kabının her bölümünden bir retina diski kesin. Optik sinir başlığına eşit mesafeden yumruk at. Önceden kaplanmış örgü uçlarını, tokmaları kullanarak diseksiyon Petri kabına aktarın.
İki süper ince kirpik fırçası yardımıyla, retinal zımba diskini, ganglion hücre katmanı tarafı örgüye ve fotoreceptör tabakası yukarı bakacak şekilde mesh kesici ucun ortasına yerleştirin. Sensör kartuşunu yüklemek için, hidratlı sensör kartuş plakası kasetini 37 santigrat derece inkübatörden çıkar. Hidro booster kapağını çıkardıktan sonra sensör kartuşunu tekrar şebeke plakasına yerleştirin.
Pipet ucunu 45 derecelik bir açıyla tutarak, pipet ucunu, ucun eğimi enjeksiyon portunun karşı duvarına karşı olan bir enjeksiyon portuna yarıya kadar sokarak, istediğiniz enjeksiyon bileşik çözelti hacmini uygun bağlantı noktalarına yükleyin. Bileşiği her bağlantı noktasına yavaşça yükleyin. Makine tepsisini açmak için çalıştırmayı başlat düğmesine tıklayarak sensör kartuşunu kalibrasyon için makineye yükleyin.
Sensör kartuşunu makineye yerleştirin ve kalibrasyonu başlatmak için Hazırım düğmesini tıklatın. Adacık yakalama plakasının her kuyusuna test ortamının istenen hacmini yükleyin. Yabanatı kullanarak, retinal zımba diskleri içeren ağ kesici ucun kenarını tutun ve Petri kabından çıkarın.
Ekstra sıvıyı çıkarmak ve adacık yakalama plakasının kuyusuna koymak için emici bir silme dokusu üzerindeki ağ kesici ucunun altına hafifçe dokunun. Retina zımbalı tüm kafes uçları, arka plan düzeltme kuyularını ve boş kafes uçlarıyla boş kuyuları dolduran adacık yakalama plakasına yerleştirene kadar bu adımı tekrarlayın. İki Graefe tokmak kullanarak, her kafes kesici ucunun kenarına dikkatlice ve nazikçe bastırın, bunların adacık yakalama plakasının altına güvenli bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
Yüklü adacık yakalama plakasını ısınmak için beş dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin, ardından kalibrasyon tamamlandıktan sonra şebeke plakasını çıkarın. Retina zımbaları içeren adacık yakalama plakası ile değiştirin ve yük hücresi plakası düğmesine tıklayarak test çalışmasına devam edin. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, çıkar düğmesine tıklayarak retina zımbaları içeren sensör kartuşunu ve adacık yakalama plakasını dışarı çıkar, ardından bitti düğmesini tıklatın, böylece veriler otomatik olarak bir ASYR dosyası olarak kaydedilir ve ekran otomatik olarak görüntülenecek şekilde değişir.
OCR izi gösteren mitokondriyal stres tahlili ve hem OCR hem de ECAR izini gösteren glikolitik oranlı test, yeni parçalanmış bir milimetre retina zımba diskleri kullanılarak gerçekleştirildi. Mitokondriyal stres testinde Bam15, proton gradyanını mitokondriyal ATP üretiminden ayırmaya enjekte edildi ve bu da OCR'nin maksimum seviyeye çıkmasına neden oldu. Rotenon ve antimycin A, sırasıyla kompleks bir ve kompleks üçte mitokondri solunumunu inhibe etmek için enjekte edildi ve bu da OCR'de minimum seviyeye düştü.
OCR'nin maksimal seviyesi ile bazal OCR seviyesinin son ölçümü arasındaki fark mitokondriyal rezerv kapasitesini yansıtır. Glikolitik oran testinde, rotenon ve antimisin A enjeksiyonu mitokondriyal solunumu kapatır ve glikolizi daha yükseğe sürer. Glikoliz, heksokinez bağlama için glikozla rekabet eden ve ECAR'ın minimum seviyeye düşmesine neden olan 2-deoksi-d-glikoz enjekte ederek ele geçirilir.
Gliko ECAR bazal seviyesinin son ölçüsünde gliko ECAR'ın maksimal seviyesi arasındaki fark, glikoliz rezerv kapasitesini yansıtır. Güvenilir veriler üretmek için, retina zımba disklerinin kaliteli olmasını sağlamak ve toplam diseksiyon süresini 1,5 saat içinde sınırlamak önemlidir. Deneyden sonra, bir kuyudaki retina diskinin protein içeriğinin DNA'sını ölçebilir ve bunu denizatı verilerini normalleştirmek için kullanabilirsiniz.
Yani bu protokol retinadaki gelişimi, yaşlanmayı ve hastalığı incelemek için kullanılmıştır. Glikoz veya yağ asitleri gibi farklı yakıt substratları için doku tercihi veya güveni de analiz edildi.
