Этот протокол обеспечивает анализ в режиме реального времени двух основных биоэнергетических путей: митохондриального дыхания и гликолиза в недавно рассеченных тканях сетчатки ex vivo мыши. Традиционный анализ морских коньков был сосредоточен на культивируемых монослойных клетках, в то время как этот протокол позволяет исследователям изучать активность митохондрий в свежерасщепленных тканях, в частности сетчатке. Этот метод используется для изучения активности митохондрий и флагов гликолиза в сетчатках унаследованных моделей мышиной дегенерации сетчатки.
Это полезный инструмент для исследований сетчатки, а также имеет потенциал для применения к другим типам тканей для разработки потенциальных методов лечения. Наиболее сложной частью этого протокола является получение качественных пробивных дисков из свежерассеченной сетчатки мыши, поэтому рекомендуется, чтобы человек, который будет выполнять эту технику, имел хорошие навыки рассечения сетчатки. За день до эксперимента откройте кассету картриджа датчика и добавьте по одному миллилитру калибровочной среды к каждой лунке полезной пластины.
Инкубируйте на ночь в инкубаторе без углекислого газа при температуре 37 градусов цельсия, чтобы активировать флуорофоры. В день эксперимента готовят пробирную среду в разбавленных составных препаратах из запаса. Разогрейте пробирную среду на водяной бане 37 градусов цельсия.
Настройте программу анализа на машине, как описано в текстовой рукописи. Откройте крышку кассеты, содержащей сетчатые вставки. Пипетку восемь микролитров покрытия смешивают с каждой сетчатой вставкой, затем используйте наконечник пипетки, чтобы аккуратно распределить каплю вокруг, чтобы равномерно распределить смесь покрытия по всей сетчатой вставке.
Закройте кассету и дайте сетчатым вставкам инкубироваться при комнатной температуре в течение не менее 25 минут для впитывания. После инкубации промыть сетчатые вставки путем пипетки четырех миллилитров пробирной среды непосредственно на вкладыши. Аккуратно встряхните кассету, чтобы убедиться, что все сетчатые вставки промыты пробирной средой.
Чтобы приготовить пунш сетчатки, энуклеируйте глаза взрослой усыпленной мыши и поместите их в ледяной PBS в чашку Петри, затем поместите чашку Петри под рассеченный микроскоп. Используя микросубчики, отрежьте зрительный нерв, затем аккуратно удалите мышцы экстраректуса, прикрепленные снаружи глазного яблока. Используя иглу 30 калибра, проделайте отверстие на краю роговицы.
Затем используйте тонкие рассечение микросубчиками, чтобы сделать круговой разрез по краю роговицы. Используя острые рассеченные щипцы, удалите роговицу, хрусталик и стекловидное тело из глазной чашки. Сделайте несколько небольших надрезов на склеральном слое на краю глазной чашки, используя тонкие рассечение микросублицоров.
Используйте два острых рассеченных щипца, чтобы удерживать склеральную ткань с каждой стороны и очень осторожно натягивать склеральный слой, чтобы удалить его из нервной сетчатки. Повторяйте это вокруг глазной чашки до тех пор, пока не будут удалены все склеры и не будет получена неповрежденная чашка сетчатки. Сделайте радиальные надрезы на чашке сетчатки, чтобы сплющить ее и создать несколько отдельных секций, используя рассечение микросублицоров.
Затем, используя перфоратор для биопсии диаметром один миллиметр, отрежьте по одному диску сетчатки из каждого участка уплощенной чашки сетчатки. Удар на равном расстоянии от головки зрительного нерва. Перенесите предварительно покрытые сетчатые вставки в рассечение чашки Петри с помощью щипцов.
С помощью двух сверхтонких ресниц поместите перфорационный диск сетчатки в центре сетчатой вставки слоем ганглиозных клеток стороной вниз, касаясь сетки и слоя фоторецептора лицом вверх. Чтобы загрузить картридж датчика, достаньте кассету с гидратированной картриджной пластиной датчика из инкубатора с температурой 37 градусов Цельсия. Сняв крышку гидроусилителя, поместите картридж датчика обратно на пластину утилиты.
Загрузите желаемый объем растворов инжекционных составов в соответствующие порты, удерживая наконечник пипетки под углом 45 градусов, вставив наконечник пипетки наполовину в инжекционное отверстие со скосом наконечника у противоположной стенки инжекционного отверстия. Осторожно загрузите соединение в каждый порт. Загрузите картридж датчика в устройство для калибровки, нажав кнопку запуска, чтобы открыть лоток устройства.
Поместите картридж датчика в устройство и нажмите кнопку «Я готов», чтобы начать калибровку. Загрузите желаемый объем пробирной среды в каждую скважину островковой захватной пластины. С помощью щипцов возьмите ободок сетчатой вставки, содержащей перфораторные диски сетчатки, и выньте его из чашки Петри.
Слегка постучите по нижней части сетчатой вставки по впитывающей салфетке, чтобы удалить лишнюю жидкость, и поместите ее в колодец пластины захвата островка. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока все сетчатые вставки с перфораторами сетчатки не будут помещены в пластину захвата островка, заполняющую фоновые корректирующие колодцы и пустые колодцы пустыми сетчатыми вставками. Используя два щипца Graefe, осторожно и осторожно нажмите на обод каждой сетчатой вставки, убедившись, что они надежно вставлены в нижнюю часть пластины захвата островка.
Поместите загруженную пластину захвата островка в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на пять минут, чтобы прогреться, а затем извлеките полезную пластину после завершения калибровки. Замените его пластиной захвата островка, содержащей перфораторы сетчатки, и возобновите выполнение анализа, нажав кнопку пластины тензодатчика. После завершения запуска извлеките картридж датчика и пластину захвата островка, содержащую перфораторы сетчатки, нажав кнопку извлечения, затем нажмите кнопку «Готово», чтобы данные автоматически сохранялись в виде файла ASYR и автоматически меняли экран для отображения результата.
Анализ митохондриального стресса, показывающий след OCR и анализ гликолитической скорости, показывающий как OCR, так и след ECAR, был выполнен с использованием недавно рассеченных одномиллиметровых перфораторных дисков сетчатки. В анализе митохондриального стресса Bam15 вводили для отделения протонного градиента от митохондриальной продукции АТФ, что приводило к увеличению OCR до максимального уровня. Ротенон и антимицин А вводили для ингибирования дыхания митохондрий в комплексе один и комплексе три соответственно, что приводило к падению OCR до минимального уровня.
Разница между максимальным уровнем OCR и последним измерением базального уровня OCR отражает емкость митохондриального резерва. В анализе гликолитической скорости инъекция ротенона и антимицина А отключает митохондриальное дыхание и повышает гликолиз. Гликолиз захватывается путем инъекции 2-дезокси-d-глюкозы, которая конкурирует с глюкозой за связывание гексокиназы, в результате чего ECAR падает до минимального уровня.
Разница между максимальным уровнем глико ECAR в последнем измерении базального уровня глико ECAR отражает емкость резерва гликолиза. Для получения достоверных данных крайне важно получить диски хорошего качества перфораторных дисков сетчатки и ограничить общее время рассечения в течение 1,5 часов. После эксперимента можно количественно оценить содержание белка в ДНК диска сетчатки в скважине и использовать это для нормализации данных о морских коньках.
Таким образом, этот протокол был использован для изучения развития, старения и заболеваний в сетчатке. Также были проанализированы предпочтения или зависимость тканей от различных топливных субстратов, таких как глюкоза или жирные кислоты.
