תצוגת פאג ' לא רק מסייעת לנו לחקור את המאפיינים המחייבים של אנזימים חשובים מבחינה קלינית, אלא גם לפתח אפננים לאותם אנזימים ולמחלות המתאימות. תצוגת Phage יכולה לשמש לפיתוח קלסרים חדשניים עבור מגוון רחב של חלבוני יעד והיא גם קלה יותר לביצוע מאשר שיטות תצוגה קונבנציונליות אחרות. הליך זה כלל הרבה פעולה חוזרת ונשנית, ולכן המפתח הוא לא טייס אוטומטי ולהישאר ממוקד לאורך כל הדרך.
התחל על ידי חנק 30 מיליליטר של ציר טטרציקלין 2YT עם 200 microliters של תרבות הזרעים. לדגור אותו במשך כשלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 200 סל"ד רעד מסלולי עד החיידקים נמצאים בשלב אמצע היומן. יש להשליך את תמסת הציפוי מהצלחת לכיור.
יבש אותו בעדינות עם מגבות נייר. לאחר מכן להוסיף 200 microliters של חוצץ PB לכל באר מצופה. יש להשליך את חיץ ה-PB מהצלחת ולייבש אותו על מגבות נייר.
מוסיפים עוד 200 מיקרוליטרים של חוצץ PB לכל באר מצופה של הצלחת. לדגור אותו בטמפרטורת החדר במשך שעה עם 300 סל"ד רעד מסלולי. להפשיר את ספריית הפאג' על הקרח, ואז לדלל אותה לפי 100 מהמגוון בספרייה ב-PBS.
מוסיפים את תמיסת הנתרן כלורי פוליאתילן גליקול בחמישית מנפח הספרייה המדוללת ודגרים את הפתרון על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה הפתרון ב 11, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. להשליך את supernatant צנטריפוגה אותו עוד שתי דקות כדי למשוך את supernatant הנותרים ולרכז את גלולה פאג '.
בעדינות resuspened את גלולה פאג במיליליטר אחד של חוצץ PBT לכל חלבון היעד להיות מנותח, בדרך כלל ארבעה בסך הכל. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של ספריית פאג' לכל באר מצופה בלוח הבקרה. לדגור אותו בטמפרטורת החדר במשך שעה עם 300 סל"ד רעד מסלולי.
יש להשליך את חיץ ה-PB מצלחת היעד לכיור ולייבש את הצלחת על מגבות נייר. מעבירים את כל 100 המיקרו-לייטרים של ספריית הפאג' בלוח הבקרה לכל באר מצופה של לוחית המטרה. לדגור אותו בטמפרטורת החדר במשך שעה עם 300 סל"ד רעד מסלולי.
לאחר מכן, להסיר את ספריית פאג מהצלחת ולשטוף את הבארות מצופות ארבע פעמים עם חוצץ PT. הפוך את הצלחת והקש על מגבת נייר כדי להסיר את טיפות החיץ האחרונות. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חומצה הידרוכלורית טוחנת 0.1 לכל באר מצופה כדי לחמוק מהפיג'.
לדגור על הצלחת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות עם 300 סל"ד רעד מסלולי. לאחר מכן, לנטרל את ה- pH על ידי הוספת 12.5 מיקרוליטרים של pH 11 טריס הידרוכלוריד טוחנת אחת לכל באר מצופה. מעבירים את הפאג' הנבה מכל שמונה בארות לצינור מיקרוצנטריפוגה יחיד של 1.5 מיליליטר.
פיפטה למעלה ולמטה במהלך ההעברה כדי להפוך פתרונות הומוגניים ושאיפה כל נוזל מן בארות. הוסף 10% BSA ל phage eluted כדי להפוך את הריכוז הסופי 1%לאחסן את צינור microcentrifuge בארבע מעלות צלזיוס. זהו הפלט העגול הראשון.
הכן תרבות זרעים לפולחן קלט הפאג ' לסיבוב הבחירה הבא על ידי חנק חמישה מיליליטרים של תרבות זרעי טטרציקלין 2YT עם מושבת E.coli מבודדת מצלחת אגר. לדגור אותו לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 200 סל"ד רעד מסלולית. לדלל את חלבון היעד בסיבובים שניים ושלוש צינור עם כמות מתאימה של PBS.
יש ליטול מחצית מתכולת הסיבובים 2 ו-3 צינור ומצפה ארבע בארות לכל חלבון יעד בלוח כריכה של 96 בארות לסיבוב הבא. לאחר מכן, השתמש בחצי מהפלט העגול כדי לחסן שלושה מיליליטרים של תאי פאזה באמצע יומן הרישום. לדגור אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם 200 סל"ד רעד מסלולית.
הוסף M13KO7 עוזר פאג לריכוז סופי של 10 מיליארד PFU למיליליטר. לדגור אותו שוב ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה עם 200 סל"ד רעד מסלולי. לאחר שעה, להעביר את כל שלושת מיליליטר של תרבות ל 30 מיליליטר של פתרון 2YT carbenicillin kanamycin.
לגדול לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 200 סל"ד רעד מסלולית. התוצאות הייצוגיות לבחירה בגרסה בכל מקום מול UBE4B מוצגות כאן. UBVs הוזמנו מהתדירות הגבוהה ביותר לנמוכים ביותר.
רצפים מייצגים את אזור היוביקוויטין המגוון ב- UBV עם כל השאריות האקראיות. הזיקה המחייבת היחסית של הקלסרים לחלבון היעד של סוג הבר, חלבון היעד שעבר מוטציה, כמו גם חלבונים מחוץ למטרה נמדדת על ידי חיסון הקשור לאנזים או ELISA. כל ספיגות ELISA היו מנורמלות מול 96 ציוני BSA ELISA בממוצע ו 96 ציונים ממוצעים GST ELISA.
ירוק כהה יותר מייצג את הכריכה היחסית החזקה יותר. GST נכלל כפקד עבור כריכה לא מינית מכיוון שחלבון היעד מתויג GST. תוצאות ELISA מוצגות כאן באופן גרפי.
ציר ה- x מייצג את ה- UBVs וציר ה- y מייצג את הספיגה המנורמלת המתאימה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב כי אתה לא להשליך את הפתרון בצלחת לאחר הוספת חומצה הידרוכלורית. הפאג'ים מושעים כעת בפתרון וברצונך לשמור אותם כך שתוכלו לבצע ניתוחים אחרונים של העשרה או שניהם.
לאחר הליך זה, יש לבצע רצף כדי לקבוע תדרי UBV. ELISAs ובבדיקות IC50 ניתן לעשות כדי לקבוע יעילות מחייבת ויעילות מעכבות בהתאמה וגם כדי לעזור לקבוע אילו UBVs לאפיין עוד יותר.
