המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לנתח היבטים מרכזיים חשובים של פונקציית ligase E3, כולל ספציפיות אנזימים E2, בחירת מצע והעברת ubiquitin. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הישימות הרחבה שלה, כמו חלבונים מכל המקורות האוקריוטיים ניתן לבטא מחדש ולמד במבחנה ללא צורך בציוד מיוחד. בעת שימוש בטכניקת פריקה ליזין בפעם הראשונה, חשוב לייעל פרמטרים של בדיקת אנזים, כגון ריכוזי אנזימים, כדי לזהות את תנאי הפריקה האידיאליים עבור ligase E3 של בחירה.
כדי לבצע בדיקה במבחנה אוטומטית בכל מקום, להגדיר ערכת pipetting כדי לבדוק את היכולת התפקודית של אנזימי E2 שונים ולהכין תערובת מאסטר על קרח עבור כל התגובות בכל מקום בתוספת תגובה אחת נוספת. לאחר מכן, להוסיף micromolar אחד של אנזימי E2 צינורות המתאימים, ודגור את הדגימות רוכב אופניים תרמי PCR במשך שעתיים בתנאים שצוינו. לאחר הדגירה, הוסף מאגר מדגם SDS לכל תגובה ומערבב על ידי צנרת מספר פעמים.
ואז מיד להרתיח את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולאחסן את החלבונים denatured ב 20 מעלות צלזיוס. כדי לבצע בדיקה מצע במבחנה בכל זמן, להכין את ערכת pipetting עבור כל התגובות. לאחר חישוב כמות תערובת האב הנדרשת לתגובה אחת, הכינו את תערובת המאסטר לכל התגובות על הקרח והוסיפו את תערובת המאסטר לכל צינור.
הוסף את רצועות E3 המתאימות בנפרד. ואז לדגור על הדגימות ב- PCR אופנוע תרמי במשך שעתיים כפי שהוכח. בסוף הדגירה, להוסיף פעמיים SDS חוצץ מדגם לכל תגובה, לערבב מספר פעמים על ידי pipetting, ולהרתיח את הדגימות במשך חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס.
כדי לבצע בדיקת פריקה ליצין, להגדיר את ערכת pipetting עבור תגובת הטעינה ולדגירה את תגובות הטעינה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לעצור את תגובת הטעינה, להוסיף apyrase לריכוז הסופי של 1.8 יחידות למיליליטר ודגורה התגובה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, להוסיף EDTA לריכוז הסופי של 30 מילימולר ולהשתמש במים מזוקקים כפולים כדי להתאים את נפח התגובה ל 30 microliters.
כדי לפרוק E2 בכל עת על ידי E3, להגדיר חמישה צינורות המתאימים לנקודות הזמן עבור הניסוי, להוסיף 6.7 microliters של חיץ מדגם שאינו מצמצם לכל צינור, להסיר שישה microliters של תגובת הטעינה הפסיק מנקודת הזמן אפס צינור, ולהתאים את הנפח הכולל ל 26.7 microliters. כדי להגדיר את תגובות הפריקה, להוסיף מים מזוקקים כפולים, מאגר בכל זמן, BSA, ליסין, E3 ligase ואת E2 טעון לכל תגובה. לאחר פרקי הזמן שנבחרו, העבר דגימות של 20 מיקרוליטר מכל תגובת פריקה לצינור המדגם המתאים.
ואז מיד מערבולת את הדגימות, ומניחים אותם ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בניתוח כתם מערבי מייצג זה, שבב לא פעיל לא היה אוטומטי בכל זמן. עם זאת, מוצרי ubiquitin עצמאי E3 נוצרו בנוכחות שבב לא פעיל ובהיעדר שבב.
שבב מסוג בר היה אוטומטי בכל מקום בשילוב עם החלבונים של UBE2D ומשפחות UBE2E, ואילו שרשראות פוליוביקוויטין חינם יוצרו בשיתוף עם החלבונים של משפחת UBE2D אבל לא עם החלבונים של משפחת UBE2E. כריכת היוביקוויטין על ידי UBE2N / V1 כיוונה את היווצרותן של שרשראות יוביקוויטין בחינם. ה- auto-ubiquitylation וכל מקום של UNC-45B נצפתה עם שבב מסוג פראי אך לא עם המוטציה הלא פעילה של CHIP, מה שמצביע על כך UNC-45B פועל כמצע שמור עבור CHIP.
כאשר הפעילות הקטליטית של CHIP נותחה באמצעות מטען פריקה ליזין, האנזים UBE2D2 לא טעון היה משקל מולקולרי של 17 קילודלטון ואת UBE2D2 טעון עם מולקולת יוביקוויטין אחת היה משקל מולקולרי של כ 26 קילודלטון. בזמן 0, כל תשואת E2 הטעון נצפתה. בנוכחות שבב לא פעיל, פריקה E3 קלושה עצמאית ligase של UBE2D2 אבל לא אוטומטי בכל מקום של CHIP זוהה.
בנוכחות שבב מסוג פראי, הפריקה של UBE2D2 הייתה מהירה והושלמה תוך 60 דקות, וההנחיה האוטומטית של CHIP הצביעה על העברה של אוביקוויטין לשאריות ליצין משלו. בשל היכולת המוגבלת E2, לעבוד מהר ככל האפשר ומיד להמשיך עם תגובת הפריקה ואחריו SDS-PAGE ו- Western blotting. בעקבות פרוטוקולי ההזנה במבחנה, ניתן לזהות את סוגי ההצמדה הספציפיים בכל העולם על ידי חקר הכתמים המערביים בנוגדנים ספציפיים להצמדה.
