כאן, אנו מתארים שיטת הדרכה המבוססת על אי-אקטיביציה מהירה של פרוטאז כדי לשמר פפטידים תאיים טבעיים, למנוע השפלה בתאים וברקמות, ואחריו כמות יחסית של פפטידים באמצעות תיוג איזוטופי. לשיטת תיוג זו יש כל כך הרבה יתרונות. ריאגנטים זמינים מסחרית, זולים, יציבים מבחינה כימית, ומאפשרים ניתוח של עד חמש דגימות בסרום אחד.
התחל על ידי טיפוח תאי נוירובלסטומה אנושיים בצלחת 15 ס"מ ב- DMEM המכילה 15% FBS ו 1%פניצילין סטרפטומיצין. לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, ולאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר של PBS, לגרד את התאים, ולאסוף אותם לתוך צינור 15 מיליליטר.
צנטריפוגות התאים ב 800 פעמים G במשך חמש דקות ולהסיר את supernatant. resuspend הכדור במיליליטר אחד של מים דה-יוניים מטוהרים במיוחד ב 80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להעביר את התוכן של הצינור לצינור מיקרופוגה שני מיליליטר. לאחר אי-פעילות חום של דגי זברה, אסוף את כל המוח בצינור מיקרו-פוגה של שני מיליליטר והקפיא אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח.
resuspend דגימת הרקמה במיליליטר אחד של מים דה-יוניים מטוהרים במיוחד ב 80 מעלות צלזיוס sonicate עם בדיקה באמצעות 30 פולסים של שנייה אחת. לדגור על הרקמה הסלולר lysate או הומוגני ב 80 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, ולאחר מכן לקרר אותו על קרח במשך 10 עד 30 דקות. הוסף 10 מיקרוליטרים של תמיסת ציר חומצה הידרוכלורית טוחנת אחת עבור כל מיליליטר אחד של נפח המדגם.
מערבבים על ידי מערבולת במשך 20 שניות ודגרה על קרח במשך 15 דקות. צנטריפוגט את ליסאט התא או את הרקמה הומוגנית ב 12, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאסוף את supernatant בצינורות microcentrifuge חלבון מחייב נמוך ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס.
נקה את התקני האולטרה סינון במים וצנטריפוגה ב- 2, 300 פעמים G במשך שלוש דקות, ולאחר מכן להשליך את המים מהתקן סינון אולטרה. פיפטה הסופר-נט לתוך מסנן חיתוך 10 קילודלטון שטוף מראש ומסתובב בצנטריפוגה בקירור בארבע מעלות צלזיוס. בדוק את רמת ה-pH של הדגימה.
שיווי משקל את העמודה עם מיליליטר אחד של 100% acetonitrile, ולאחר מכן לשטוף אותו עם מיליליטר אחד של 5% acetonitrile עם 0.1%חומצה טריפלואורואצטית. לטעון את הנפח המלא של המדגם בעמודה לשטוף את העמודה עם מיליליטר אחד של 5% acetonitrile עם 0.1%חומצה trifluoroacetic. אלימו את הפפטידים מהטור עם 1.8 מיליליטר של 1%acetonitrile עם 0.15%חומצה טריפלואורואצטית לצינורות מיקרוצנטריפוגה בעלי קשירה נמוכה של חלבון.
ייבשו את הדגימה לחלוטין בצנטריפוגת ואקום ב-30 מעלות צלזיוס וניטרו את זמן הריכוז המוצג. לאחסן את המדגם במינוס 80 מעלות צלזיוס. resuspend דגימות פפטיד ב 100 עד 200 microliters של מים מטוהרים במיוחד פיפטה 2.5 מיקרוליטרים של ריכוזי פפטיד סטנדרטיים ודגימות על צלחת לבן 96 באר.
הוסף 25 מיקרוליטרים של 0.2 חוצץ פוספט טוחן ו 12.5 מיקרוליטרים של פלואורסצמין. הומוגניזציה בעדינות במשך דקה אחת על המסובב מסלולית. לאחר מכן, להוסיף 110 microliters של מים כדי לעצור את התגובה.
כוונן את ההגדרות על הספקטרופלואורומטר ולאחר מכן קרא את הצלחת. הוסיפו נפח 1/10 של טרימתילמוניום ברומיד טוחנת אחד לכל דגימת פפטיד עם עד 25 מיקרוגרם של הפפטיד. ודא כי ה- pH הוא בין חמש לשמונה, התאמה עם חומצה הידרוכלורית או נתרן הידרוקסיד, במידת הצורך.
הוסף ארבעה מיקרוליטרים של פורמלדהיד לא מפורסמים, מפורסמים או פחמן-13 מפורלדהיד מפורקטים. מערבבים במשך חמש שניות על ידי מערבולת. הוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של נתרן ציאנובורוהידריד או נתרן ציאנובורוהידריד מפורק לדגימת הפפטיד.
ואז לערבב את המדגם במשך חמש שניות על ידי מערבולת. לדגור על דגימת הפפטיד במכסה המנוע במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, מערבולת כל 30 דקות. חזור על התוספת של לא deuterated, deuterated, או פחמן-13 מפורלדהיד מפורלדהיד נתרן ציאנובורוהידריד או נתרן deuterated ציאנובורוהידריד, מערבולת לאחר כל תוספת.
לדגור את הדגימות במכסה המנוע האדים לילה בטמפרטורת החדר. מוסיפים 16 מיקרוליטרים של אמוניום ביקרבונט ומערבבים על ידי מערבולת. מניחים את הדגימה על קרח.
הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של 5% חומצה ומערבולת לחמש שניות נוספות. שלב את דגימות הפפטיד, להתאים את ה- pH בין שתיים לארבע, ולאחר מכן להתפלת הדגימות המשולבות על עמודות ניקוי פאזה הפוכות באמצעות acetonitrile וחומצה trifluoroacetic כפי שתואר בעבר. יבשו את המדגם כולו בצנטריפוגת ואקום ב-30 מעלות צלזיוס, ואז אחסנו אותה במינוס 20 מעלות צלזיוס.
הפפטידים המסומנים נצפים באמצעות ספקטרום מסה. חצים אדומים מצביעים על נוכחות של זוגות שיא של פפטידים שונים המסומנים בשתי צורות איזוטופיות, L1 ו- L5, להשוואה בין שתי דגימות שונות S1 ו- S2 בהתאמה. ספקטרום המסה של פפטיד הנמצא בשלוש דגימות שונות, S1, S2 ו- S3, המסומן בתגי L1, L3 ו- L5 בהתאמה מוצג כאן.
בוצע תיוג מרובע. דגימות בקרה S1 ו- S3 סומנו עם L1 ו- L3 בהתאמה בהשוואה לשתי דגימות ניסיוניות, S2 ו- S4 המסומנות ב- L2 ו- L4.No נצפתה הבדל משמעותי. תיוג איזוטופי שימש להצגת מצעים במוצרים במבחנה עבור פרוטאז נתון או פפטידאז.
פפטיד שאינו משתנה בנוכחות האנזים הנוירוליסין מוצג כאן. פפטידים שנעלמים או מפחיתים בנוכחות האנזים הם מצעים, ואילו אלה הגדלים נחשבים למוצרים. האיור הוא דוגמה לזיהוי רצף פפטיד המבוצע על ידי מנוע חיפוש של מסד נתונים המסומן בשלוש צורות שונות של תגים.
לפני שהוא מוגדר, ודא המדגם הוא מגניב לחלוטין כדי למנוע שבירת קשרים פפטיד שנגרם על ידי החמצה קשה. בנוסף, ניקוי של התקני סינון אולטרה הוא חיוני. ספקטרומטריית מסה היא שיטה מצוינת לכמת פפטידים בין תנאי ניסוי שונים לניתוח מחקרים על ידי זיהוי מצעים פפטידג.
