המחברים רוצים להודות סלין ג'נטי על עזרתה ביצירת כדורי הסלולר עם טיפול MG-132 כמתואר בתוצאות הייצוג ואליז Mommaerts עבור מתן כדורי E. coli בשימוש בפרוטוקול.

1. הכנת תקן פפטיד כבד
<ol><li>בהתאם לספק ואיכות הפפטידים הכבדים שנרכשו, יהיה צורך לדלל את הפפטידים הכבדים. פרוטוקול זה השתמש רצפי פפטיד שדווחו בטבלה 1, עם חומצת אמינו C-מסוף שונה ליצין(13C615N2-ליצין) או ארגינין (13C615N4-ארגנין).<ol>
<li>מערבבים את הפפטידים הכבדים, מדללים את התערובת עם 50% אצטוניטריל (ACN) כדי ליצור תערובת פפטיד עם כל פפטיד ב 10 מיקרומטר.</li>
		<li>צור aliquots של תערובת פפטיד ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנה לדוגמה
<ol><li>תמוגה לדוגמה הערה: יש לקחת בחשבון את היציבות של שרשראות ubiquitin במהלך הכנת מדגם. יש לשמור על דגימות ביולוגיות ומאגרים מצוננים ב-4 מעלות צלזיוס ולהוסיף דגימות למאגר ייצוב האוביקוויטין במהירות האפשרית.<ol>
<li>הכן פתרון של 1 M NH4HCO3 (אמוניום ביקרבונט) במים ולהתאים את ה- pH ל 8 באמצעות 1 M NaOH.</li>
		<li>הכינו פתרון של 200 מ"מ N-אתילמלימיד (NEM) במים.</li>
		<li>הכן מאגר ייצוב ubiquitin באמצעות 8 M אוריאה ב 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. מאגר ייצוב Ubiquitin חייב להיות מוכן טרי בכל פעם. הערה: פתרון 5 מ"ל של 8 M אוריאה ידרוש הרבה פחות מ 5 מ"ל של מים בהתחשב בהרחבת המים כאשר בתמיסה רוויה עם אוריאה. התראה: אין להכין את המאגר מעל 50 מעלות צלזיוס בשל הנטייה של אוריאה ליצור פוליאוריאה בטמפרטורות גבוהות.</li>
		<li>Resuspend המדגם הביולוגי להיחקר במאגר ייצוב ubiquitin מכוון 0.5 מיקרוגרם / μL של חלבון lyse התאים עם שיטה מתאימה עבור המדגם. שיטת sonication המורכבת שלושה פולסים 10 s עם סוניפייר ברנסון SFX 150 להגדיר בעוצמה של 70% עם 10 הפסקות על הקרח בין כל פעימה, שימש עבור קווי התא בפרוטוקול זה.</li>
		<li>דגימת צנטריפוגה ב 18,000 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה שולחן.</li>
		<li>מעבירים את ה-supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי עם חלבון נמוך. דגימות ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס בשלב זה במידת הצורך.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת מדגם ופקדים
	<ol>
<li>אם הדגימות קפואות, מערבבים (למשל, עם תרמומיקסר) בזמן שהם מופשרים כדי להמיס במהירות את אוריאה. התראה: אין להשתמש בטמפרטורות מעל 50 °C (60 °F) בשל הנטייה של אוריאה ליצור פוליאוריאה בטמפרטורות גבוהות.</li>
		<li>דגימת צנטריפוגה ב 18,000 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה שולחן.</li>
		<li>העבר 20 מיקרוגרם של מדגם לצינור מיקרוצנטריפוגה נמוך טרי ולהתאים את עוצמת הקול ל 50 μL עם מאגר ייצוב ubiquitin.</li>
		<li>צור פקד שלילי באמצעות נפח מנורמל של מאגר ייצוב ubiquitin (50 μL). במדגם זה, אין גרסה קלה של כל פפטיד צריך להיות נוכח, המאפשר תצפית של כל זיהום אור הנובע ספייק בפפטידים כבדים. פקד שלילי זה שימש גם לשמירת תזמון זמן של PRM המתואר בסעיף 3.1.</li>
		<li>שליטה חיובית נוצרה גם עם מאגר ייצוב ubiquitin ותוספת של סוגי שרשרת זמינים מסחרית לנפח מנורמל של מאגר ייצוב ubiquitin (50 μL). בדרך כלל, K63, K48 ו- M1 זמינים. בתוצאות הייצוגיות נוצלו 20 ng של K48, K63 ו- M1.</li>
	</ol></li>
	<li>הפחתה, אלקילציה ועיכול
	<ol>
<li>הכן פתרון של 50 מ"מ אמוניום ביקרבונט (NH4HCO3)במים ולהתאים את המדגם ל- pH = 8 עם 1 M NaOH.</li>
		<li>תרבות של E. coli גדל מרק LB היה צנטריפוגה 5,000 x g במשך 5 דקות כדי ליצור גלולה, אשר נשטף אז 2x עם PBS לפני ההשעיה במאגר ייצוב ubiquitin ב 5 מיקרוגרם / μL.</li>
		<li>הוסף 1 מיקרוגרם של E. coli lysate לכל מדגם ושליטה. פרוטוקול זה משתמש E. coli (DH10B), אבל כל lysate מורכב ללא ubiquitin ניתן להשתמש. שים לב כי אוביקוויטין משותף לכל האיקריוטים. הערה: שימוש במטריצת E. coli lysate מפחית את אובדן הפפטידים עקב הידבקות לא ספציפית בכלי פלסטיק. זה בולט במיוחד בשליטה השלילית או דגימות עם תכולת חלבון מוגבלת ויש לו השפעה חזקה על התצפית של K6312.</li>
		<li>הכן פתרון של 500 mM tris (2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) במים כיתה MS (DTT יכול לשמש כחלופה).</li>
		<li>להפחית את הדגימות ואת הפקדים על ידי תוספת של TCEP לריכוז הסופי של 50 מ"מ. וורטקס בקצרה לפני הדגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). אם נעשה שימוש ב- DTT, יש להעלות את הטמפרטורה ל- 50 °C (60 °F). התראה: אין להשתמש בטמפרטורות מעל 50 °C (60 °F) בשל הנטייה של אוריאה ליצור פוליאוריאה בטמפרטורות גבוהות.</li>
		<li>הכינו פתרון של 550 מ"מ כלורואקטמיד (CAA) ב- NH4HCO3. חנות בחושך.</li>
		<li>Alkylate דגימות ופקדים על ידי הוספת CAA לריכוז הסופי של 55 mM. וורטקס בקצרה לפני הדגירה במשך 20 דקות ב RT בחושך. הערה: CAA משמש במקום iodoacetamide כסוכן ההפחתה כדי להקטין את הסיכוי של שינוי carbamidomethyl כפול (114.0429) על שאריות ליצין להיות טועה עבור -GG שינוי (114.0429)13.</li>
		<li>הוסף אנדופטידאז LysC לדגימות ב 1:25 (w / w) יחס לתכולת החלבון. דגירה במשך 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לדלל את הדגימות ואת הפקדים עם 200 μL של 50 מ"מ NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v / v).</li>
		<li>הוסף טריפסין לדגימות ב 1:25 w / w יחס לתכולת החלבון. דגירה עבור 12 שעות ב 37 °C (69 °F).</li>
		<li>הוסף 10% חומצה פורמית (FA) פתרון במים כיתה MS ביחס 1:10 v / v לכל מדגם מדגם ובקרה. בדוק כי pH הוא <3) לפני ניקוי C18 ולהוסיף חומצה פורמית יותר במידת הצורך.</li>
		<li>לכל דגימה ובקרה להוסיף 0.5 μL של תקן פפטיד כבד שנוצר בסעיף 1.</li>
	</ol></li>
	<li>ניקוי פפטיד
	<ol>
<li>מספר יצרנים מציעים C18 טיפים ניקוי או צלחות. בצע את הוראות היצרן עבור המוצר בשימוש, ופפטידים מיובשים בצנטריפוגה ואקום, מוכן לניתוח MS.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ניתוח על ידי LC-MS / MS
<ol><li>בצע ניתוח PRM ראשוני על תקן פפטיד כבד בצורה לא מתוכננת.<ol>
<li>Resuspend את הדגימות המיובשות ב 10 μL של מאגר טעינה MS 2% ACN / 0.05% חומצה trifluoroacetic (TFA).</li>
		<li>צייד HPLC בעמודה אנליטית שלב הפוך C18 (75 מיקרומטר x 15 ס"מ, 2 מיקרומטר 100 Å C18 חרוזים) המיועדת לננו זרימה MS. טופס הדרגתי ליניארי החלפת מים בדרגת MS בתוספת 0.1% FA עם ACN המכיל 0.1% FA. עמודת מלכודת הקרבה (75 מיקרומטר x 2 ס"מ, 3 מיקרומטר, 100 Å C18 חרוזים) כדי לשמר את חיי העמודה האנליטית שימשה כאן אך אינה נדרשת.</li>
		<li>תצמד את התפוקה של העמודה האנליטית למקור ננו-ESI בספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה.</li>
		<li>השתמש בשיטת פרוטאומיקה ממוקדת מתאימה עבור ספקטרומטר המסה. לדוגמה, בשיטת Q-Exactive פלוס שיטת שני ניסויים, יש לעבור בין MS מלא לניסוי PRM. עבור הניסוי MS מלא, רזולוציה של 120,000 עם יעד AGC של 1e6 ו 240 ms כמו ה-IT המרבי שימש. עבור ניסוי PRM, נעשה שימוש באותו יעד AGC וב- IT מרבי ברזולוציה נמוכה יותר של 60,000 וחלון בידוד של 1.2 m/z.</li>
		<li>הזרק 200 ng של הפקד השלילי על העמודה האנליטית באמצעות דגימה אוטומטית HPLC. החל הדרגתי ליניארי על המדגם בעמודה האנליטית הגדלת ריכוז ACN מ 2-25% על פני תקופה של ~ 45 דקות. הערה: ריכוז ACN 25% נמוך מהרגיל עבור פרוטאומיקה בשל האופי ההידרופילי הנמוך של פפטידים טיפוסיים האופייניים לטופולוגיית אוביקוויטין. אם פפטידים אחרים יש לכמת, ריכוז ACN גבוה יותר עשוי להיות הרצוי כדי להשיג הפרדת יעד טובה.</li>
		<li>נתח את תוצאות הפעלת התזמון כמתואר בסעיף 4.2 כדי ליצור רשימת כלילה מתוזמנת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח הדגימות<ol>
<li>הפעל את הדוגמאות הנותרות כמתואר עבור התזמון ב- 3.1 מלבד השימוש ברשימת ההכללה המתוזמנת שנוצרה בסעיף 4.2. הערה: יש להפעיל ריק לאחר הפקד החיובי כדי להבטיח שלא יתגלה מסירה מההפעלה הקודמת בדגימות הבאות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ניתוח תוכנה
<ol><li>צור רשימת כלילה של עיצוב מתאים עבור MS מנוצל. פרוטוקול זה השתמש בתוכנת הקוד הפתוח Skyline (גירסה 19.1.0.193) (https://skyline.ms), המציעה תמיכה ועזרה מתועדות היטב. ניתן ליצור רשימת כלילה עבור מספר ספקטרומטרים של מסה באמצעות מתקן רשימת בידוד הייצוא.<ol>
<li>פתח מסמך קו רקיע חדש.</li>
		<li>בחר שינויים כבדים איזוטופ בהתאם לצורך פפטידים אופייניים טופולוגיה כבדה. בהגדרות| הגדרות פפטיד תחת הכרטיסיה שינוי, לחץ על שדה השם כדי לראות את השינוי הפוטנציאלי. הבחירה מבוססת על המצב האיזוטופי של הפפטידים הכבדים שנרכשו. בדוגמה זו, פפטידים סינתטיים הנושאים לידין כבד (13C615N2-לידין) או ארגינין כבד (13C615N4-ארגנין) ב C-terminus שימשו. התוויות המתאימות יהיו: "תווית:13C(6)15N(2) (C-מונח K)" ו"תווית:13C(6)15N(4) (C-מונח R)".</li>
		<li>בחר הגדרות| מעבר . תחת הכרטיסיה מסנן כוללים חיובים מבשר 2, 3, 4.</li>
		<li>הוסף פפטידים על-ידי בחירה באפשרות ערוך| הוסף| פפטידים.</li>
		<li>מלאו את התחומים הרלוונטיים, כולל רצף הפפטיד האופייני לטופולוגיה ושם חלבון (למשל, "שרשרת–K63").</li>
		<li>הרחיבו כל פפטיד המוצג כעת בחלונית 'מטרות'. מחק מצבי חיוב לא רצויים. מצב הטעינה המועדף ואנרגיית התנגשות, אשר עשויים להיות שונים בהתבסס על ספקטרומטר מסה בשימוש, עבור כל פפטיד טופולוגי אופייני מוצג בטבלה 1.</li>
		<li>עבור כל פפטיד האופייני לטופולוגיה (למעט M1 שבו GG נכלל ברצף) לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הרצף ובחר שנה. הוסף GG כשינוי מבני על-ידי לחיצה על שדה השם ובחירה באפשרות <הצג את כל... > לפני בחירת "גליגלי (K)".</li>
		<li>יצא את קובץ רשימת הבידוד| יצא| רשימת בידוד, בחר את סוג הכלי והגדר את סוג פעולת השירות כ רגיל. בחירה בלחצן אישור תפתח בקשה לשמירת קובץ *.csv בו ניתן להשתמש כדי ליצור פעולת שירות PRM.</li>
	</ol></li>
	<li>צור רשימת כלילה מתוזמנת המבוססת על הפעלת תזמון פפטיד כבדה המוסברת כאן באמצעות תוכנת קו הרקיע בקוד פתוח.<ol>
<li>צור רשימת יעד כמתואר בסעיף 4.1.</li>
		<li>יבא את הפעלת התזמון ב- 3.1 על-ידי בחירה באפשרות קובץ| ייבוא| תוצאות .</li>
		<li>סקור את הזיהויים. האות הכבד עבור כל פפטיד ניתן לצפייה על ידי לחיצה על המסה עבור כל כניסת פפטיד כבדה. זיהוי נכון של השיא נקבע לעתים קרובות באופן אוטומטי, אך התוכנה עשויה לדרוש אוצרות ידנית על-ידי בחירת השיא באמצעות לחיצה וגרירה מתחת לציר ה- x.</li>
		<li>זמני השמירה שנבחרו עבור הווריאנטים הכבדים חלים גם על הגירסאות המוארות, ובכך יוצרים לוח זמנים עבור PRM. ניתן לשנות את חלון התזמון תחת הגדרות| הגדרות פפטיד באמצעות הכרטיסיה חיזוי, על-ידי שינוי חלון הזמן.</li>
		<li>כעת ניתן לייצא רשימת כלילה מתוזמנת באמצעות קובץ| יצא| רשימת בידוד ובחירת סוג הכלי המתאים והגדרת סוג פעולת השירות לתזמון.</li>
	</ol></li>
	<li>נתח את הנתונים.<ol>
<li>יבא את הדגימות באותו אופן כמו עבור ניתוח הפעלת התזמון בסעיף 4.2.</li>
		<li>לאחר הייבוא המלא של כל הדגימות, מומלץ לאצור מעברים. זהו התהליך שבאמצעותו מוסרים מעברים עם הפרעה או יחסי אות לרעש ירודים. דוגמה לכרומטוגרמה לפני ואחרי אוצרות מוצגת באיור 4.</li>
		<li>כעת ניתן לייצא נתונים על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על גרפים רלוונטיים ובחירת העתקת נתונים או על-ידי בחירת קובץ| יצא| תוצאות .</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+post-translational+modification+statistics:+frequency+analysis+and+curation+of+the+swiss-prot+database.">Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database.</a> Scientific Reports. 1, 90 (2011).</li><li>Goldstein, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+polypeptide+that+has+lymphocyte-differentiating+properties+and+is+probably+represented+universally+in+living+cells.">Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).</li><li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway:+Destruction+for+the+sake+of+construction.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction.</a> Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).</li><li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+structures,+functions,+mechanisms.">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li><li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance.">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li><li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+Code.">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li><li>Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ubiquitin+Binders+to+Decipher+the+Ubiquitin+Code.">Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).</li><li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+chain+editing+revealed+by+polyubiquitin+linkage-specific+antibodies.">Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies.</a> Cell. 134 (4), 668-678 (2008).</li><li>Spence, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-regulated+modification+of+the+ribosome+by+a+variant+multiubiquitin+chain.">Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain.</a> Cell. 102 (1), 67-76 (2000).</li><li>Borr&#224;s, E., Sabid&#243;, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+targeted+proteomics?+A+concise+revision+of+targeted+acquisition+and+targeted+data+analysis+in+mass+spectrometry.">What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry.</a> PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).</li><li>Lesur, A., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+application+to+targeted+proteomics.">Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics.</a> PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).</li><li>Longworth, J., Dittmar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Ubiquitin+Chain+Topology+by+Targeted+Mass+Spectrometry.">Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1977, 25-34 (2019).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li><li>Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+proteasome+reduce+the+accelerated+proteolysis+in+atrophying+rat+skeletal+muscles.">Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome.">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Collision+Energy+Optimization+on+the+Measurement+of+Peptides+by+Selected+Reaction+Monitoring+(SRM)+Mass+Spectrometry.">Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

ניתוח של מצב ubiquitin בתוך פרוטאום הוא בעל חשיבות גוברת למגוון רחב של שאלות ביולוגיות. התיאור של מצב ubiquitination של מדגם חייב להתמקד לא רק על הפרופיל של חלבונים להיות ubiquitinated, אלא גם על הטופולוגיה של ubiquitination כזה. להערכת טופולוגיה זו על ידי טרשת נפוצה ממוקדת, כמתואר כאן, יש תפקיד במגוון רחב של חקירות...

הרגולציה ההדוקה של תפקוד החלבון ויציבות היא בעלת חשיבות עליונה, שכן הם מניעים עיקריים של שליטה פנוטיפית בביולוגיה. תפקידו של חלבון בנוי משני מרכיבים: רצף הפוליפפטיד המהותי שלו וכל שינוי פוסט-טרנסלציה (PTMs). זוהו PTMs כימיים שונים כולל גליקוסילציה, זרחון, אצטילציה ומתילציה1. בשנת 1975 זיהה גולדשטיין ואח'2 חלבון קטן וקרא לו אוביקוויטין בשל אופיו בכל מקום. אוביקוויטין נמצאה חשובה בהשפלת חלבונים3. עם זאת, מאז נקבע כי הפונקציה של ubiquitin כמו מולקולת איתות משתרע הרבה מעבר ויסות יציבות החלבון. איתות Ubiquitin מעורב במגוון רחב של פונקציות ביולוגיות אחרות, כגון ייצוב חלבון, autophagy, בקרת מחזור התא, וסחר בחלבון4.
בעוד PTMs אחרים הם בדרך כלל בינארי (כלומר, החלבון משתנה או נשאר ללא שינוי) עבור אתר נתון, ubiquitin יכול לשנות חלבון הן כמונומר או כשרשרת פולימרית, עם ubiquitin המצורף עצמו להיות ubiquitinated. יתר על כן, שרשרת פוליוביקוויטין זו יכולה להתפתח במספר טופולוגיות עם ubiquitination של ubiquitin הקודם הצמדה לאחד משמונה אתרי קישור5,6. אוביקוויטין מועבר על ידי תהליך אנזימטי רב-שלבי (איור 1) שבו מסוף C של אוביקוויטין מקושר לאחד משבעת שאריות הליצין שלו (K06, K11, K27, K29, K33, K48 או K63) או מסוף N של האוביקוויטין הקודם (המכונה M1 או ubiquitination ליניארי)5,6. טופולוגיית שרשרת זו היא המפתח לגורל החלבון תחת שינוי. לדוגמה, השינוי בשרשרת מקושרת K48 או K11 מוביל לפגיעה בחלבון שהשתנה בפרוטאזום, בעוד ששרשרת ליניארית נחוצה להפעלת איתות NF-kB. לפיכך, ההפצה היחסית של טופולוגיות שרשרת אלה רלוונטית למגוון רחב של שאלות ביולוגיות.
השימוש בספקטרומטריית מסה (MS) הוא יתרון מיוחד לניתוח טופולוגיית שרשרת אוביקוויטין מכיוון שהוא אינו מסתמך על אינטראקציות מבוססות נוגדנים או מבוססות זיקה7,8, שרבות מהן ספציפיות מוגבלות ואינן מבדילות בין סוגי השרשרת השונים. אפשרות זיהוי שונה היא שימוש במוטנטים אוביקוויטין מהונדסים גנטית. כאן, ליבין מסוים מוחלף ארגינין, אשר לא יכול לתמוך בשינוי על ידי ubiquitin. חוסר היווצרות שרשרת ubiquitin על חלבון המצע מתפרש לאחר מכן כעדות לטופולוגיה ספציפית9.
זיהוי מבוסס MS של חלבונים ubiquitinated מבוסס על העובדה כי C-מסוף של ubiquitin מכיל שאריות ארגינין בתנוחה 74 כי הוא מוכר על ידי טריפסין במהלך ההכנה הפרוטאוליטית של הדגימות לניתוח טרשת נפוצה, הפרדת גליצין כפול C-מסוף. גליגלי (-GG) זה נשאר מחובר לקבוצה ε אמינו של שאריות ליצין של חלבון המצע. עבור ניתוח טופולוגית ubiquitin, השינוי מתרחשת על אחד משבעת שאריות ליצין של אוביקוויטין. פעולה זו יוצרת קבוצה של שבעה פפטידים מרכזיים הנושאים שאריות ליצין שמשתנות על-ידי GG, ספציפיות לכל אחת מהטופולוגיות (איור 2). לדוגמה, עם טופולוגיית K06, ליצין במיקום 6 על רצף חומצות אמינו יהיה מוגן מפני עיכול טריפטי עם -GG שינוי של 114 Da הוסיף ליצין זה.
זיהוי של פפטידים מוגדרים מראש ספציפיים על ידי טרשת נפוצה נקרא פרוטאומיקה ממוקדת, או ליתר דיוק, רכישת פפטידממוקדת 10. שתי שיטות פותחו בהתאם לביצועים של ספקטרומטר המסה בשימוש. אלה הם ניטור תגובה נבחר (SRM), המכונה גם ניטור תגובה מרובה (MRM), וניטור תגובה מקבילה (PRM). SRM כרוך בבחירת המעברים המורכבים מהמבשר m/z ומהיון המוצר m/z. לעומת זאת, PRM דורש רק את המבשר m/z. לאחר הבחירה, מתבצעת סריקת סקר מלאה של יוני המוצר. זה יש את היתרון כי אין מבחר של יוני מוצר מתאימים עבור כמויות על ספקטרומטר המסה הספציפי יש צורך לפני המדידה11. הן SRM והן PRM יכולים, בהתאם למכשיר, להיות מתוזמנים. תזמון הוא הנוהג של הקצאת חלון זמן שבמהלכו ייכלל יון מסוים לניתוח, שכן פפטידים מתרוממים בזמני שמירה מוגדרים מהמערכת הכרומטוגרפית. צמצום מספר היונים הנחקרים בכל זמן נתון מגדיל את תדירות החקירה של היונים המתוכננים באותה תקופה, ובכך משפר את דיוק הנתונים.
באופן כללי, היישום של פרוטאומיקה ממוקדת עבור טופולוגיית ubiquitin זהה לכל ניסוי פרוטאומיקה ממוקד אחר. עם זאת, שני הבדלים מרכזיים חשובים: ראשית, יש לשקול את היציבות של שרשראות ubiquitin. ישנם אנזימים deubiquitinating חזק מרובים (DUBs) כי במהירות להשפיל שרשראות על תמוגה התא. הפרוטאסות הספציפיות לאוביקוויטין מתחלקות לשתי קטגוריות, התיאסטרות והמתכות. רוב האוביקוויטין-הידרולאסות הן תיאסטראסים ונושאות שאריות ציסטאין במרכז הפעיל שלהן. על ידי alkylating שאריות ציסטאין זה, הם יכולים להיות מושבתים. ככזה, השימוש במאגרי ייצוב ubiquitin המכילים סוכני alkylating, כמו N-אתילמלימיד (NEM), וכימיקלים denaturing מאוד, ושמירה על דגימות מקורר חיוני לניתוח מוצלח. שנית, שלא כמו ניסויים ממוקדים אחרים, בחירת הפפטיד קבועה. בניסוי ממוקד טיפוסי, ניתן לבחור פפטיד פרוטאוטיפי לביצועים כרומטוגרפיים ויוניזציה טובים. עבור כמה פפטידים אופייניים טופולוגיה כגון K48 מאפיינים אלה טובים, ואילו עבור אחרים, הם פחות רצויים. לדוגמה, כרומטוגרפיה K33 בהגדרה הפוכה טיפוסית היא ירודה בשל היווצרות של פרופיל elution מתוח, ואת תכונות יינון לקוי של פפטיד K27 להפחית את הראות שלה על ידי MS12.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבצע הערכה טופולוגית ubiquitin של מדגם ביולוגי על ידי PRM. נתונים לדוגמה עבור ההליך מוצגים באמצעות הפרעה של פרוטאזום באמצעות טיפול מעכב MG-132 במספר סוגי תאים שונים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Microfuge 16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide (CAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBind</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy Peptides</td>
			<td>JPT Peptide Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>Ulitimate 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lys C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q-Exactive Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide (NEM)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>156100050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K48</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain K63</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-340-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Chain M1</td>
			<td>Boston Biochem</td>
			<td>UC-710B-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier</td>
			<td>Branson sonifier</td>
			<td>SFX 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer Comfort</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigam</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>77720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V1511A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters &#956;Elution C18 plates</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002318</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ubiquitin chain analysis by parallel reaction monitoring

הערכה של הפרופיל העולמי של טופולוגיות שרשרת ubiquitin בתוך פרוטאום הוא עניין לענות על מגוון רחב של שאלות ביולוגיות. הפרוטוקול המתואר כאן מנצל את השינוי di-גליצין (-GG) שנותר לאחר העיכול טריפטי של ubiquitin משולב בשרשרת. על ידי כימות אלה טופולוגיה אופייני פפטידים השפע היחסי של כל טופולוגיית שרשרת ubiquitin ניתן לקבוע. הצעדים הנדרשים לכימות פפטידים אלה על ידי ניסוי ניטור תגובה מקבילה מדווחים תוך התחשבות בייצוב של שרשראות ubiquitin. הכנת פקדים כבדים, תמוגת תאים ועיכול מתוארים יחד עם הגדרת ספקטרומטר המסה המתאימה וזרימת העבודה של ניתוח נתונים. ערכת נתונים לדוגמה עם הפרעות בטופולוגיית ubiquitin מוצגת, מלווה בדוגמאות כיצד מיטוב הפרוטוקול יכול להשפיע על התוצאות. על ידי ביצוע השלבים המתוארים, משתמש יוכל לבצע הערכה גלובלית של הנוף טופולוגית ubiquitin בתוך ההקשר הביולוגי שלהם.

כדי להדגים את השימוש בניתוח שרשרת ubiquitin על ידי PRM, שלושה קווי תאים נבחרו: קו תא מלנומה עכבר B16, ואת שני קווי התא האנושיים הנפוצים A549 (תאי אפיתל בסיסי מכתשי אדנוקרצ'ינו) ו HeLa (תאים סרטניים צוואר הרחם). תרבויות אלה גדלו לשלב midexponential במדיה המתאימה לפני שטופלו 0, 10, או 100 מ"מ MG-132 עבור 4 שעות לפני הקציר. ...

Watch this Scientific Journal Video about Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring at JoVE.com

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

שיטה זו מתארת הערכה של שינויים גלובליים בטופולוגיית שרשרת ubiquitin. ההערכה מבוצעת על ידי יישום של גישה פרוטאומית ממוקדת ספקטרומטריית מסה.

ניתוח שרשרת Ubiquitin על ידי ניטור תגובה מקבילה

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

ubiquitin-chain-analysis-by-parallel-reaction-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.5K Views.  Luxembourg Institute of Health. שיטה זו מתארת הערכה של שינויים גלובליים בטופולוגיית שרשרת ubiquitin. ההערכה מבוצעת על ידי יישום של גישה פרוטאומית ממוקדת ספקטרומטריית מסה.

Video: Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament on single-stranded DNA (ssDNA) and captures double-stranded DNA (dsDNA) non-specifically to interrogate it for a homologous sequence. After encountering homology, Rad51 catalyzes DNA strand exchange to mediate pairing of the ssDNA with the complementary strand of the dsDNA. This reaction is highly regulated by numerous accessary proteins in vivo. Although conventional biochemical assays have been successfully employed to examine the role of such accessory protein in vitro, kinetic analysis of intermediate formation and its progression into a final product has proven challenging due to the unstable and transient nature of the reaction intermediates. To observe these reaction steps directly in solution, fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based real-time observation systems of this reaction were established. Kinetic analysis of real-time observations shows that the DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 obeys a three-step reaction model involving the formation of a three-strand DNA intermediate, maturation of this intermediate, and the release of ssDNA from the mature intermediate. The Swi5-Sfr1 complex, an accessary protein conserved in eukaryotes, strongly enhances the second and third steps of this reaction. The FRET-based assays presented here enable us to uncover the molecular mechanisms through which recombination accessary proteins stimulate the DNA strand exchange activity of Rad51. The primary goal of this protocol is to enhance the repertoire of techniques available to researchers in the field of homologous recombination, particularly those working with proteins from species other than Schizosaccharomyces pombe, so that the evolutionary conservation of the findings presented herein can be determined.

Fluorescence resonance energy transfer-based real-time observation systems of the DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 were developed. Using the protocols presented here, we are able to detect the formation of reaction intermediates and their conversion into products, while also analyzing the enzymatic kinetics of the reaction.

תצפית בזמן אמת של התגובה Exchange גדיל DNA מתווכת על-ידי Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

אלקטרופורזה היברידית ברורה/כחולה עבור הפרדה וניתוח של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלי מערכות-העל

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed complexes. The latter can be elegantly resolved according to molecular size using native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Coupling of such separations to sensitive mass spectrometry (BN-MS) has been well-established and theoretically allows for exhaustive assessment of the extractable complexome in biological samples. However, this approach is rather laborious and provides limited complex size resolution and sensitivity. Also, its application has remained restricted to abundant mitochondrial and plastid proteins. Thus, for a majority of proteins, information regarding integration into stable protein complexes is still lacking. Presented here is an optimized approach for complexome profiling comprising preparative-scale BN-PAGE separation, sub-millimeter sampling of broad gel lanes by cryomicrotome slicing, and mass spectrometric analysis with label-free protein quantification. The procedures and tools for critical steps are described in detail. As an application, the report describes complexome analysis of a solubilized endosome-enriched membrane fraction from mouse kidneys, with 2,545 proteins profiled in total. The results demonstrate identification of uniform, low-abundance membrane proteins such as intracellular ion channels as well as high resolution, complex protein assembly patterns, including glycosylation isoforms. The results are in agreement with independent biochemical analyses. In summary, this methodology allows for comprehensive and unbiased identification of protein (super)complexes and their subunit composition, providing a basis for investigating stoichiometry, assembly, and interaction dynamics of protein complexes in any biological system.

A versatile cryoslicing BN-MS protocol using a microtome is presented for high-resolution complexome profiling.

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent attachment of 76 amino acid ubiquitin modifiers to a target protein, depending on the length and topology of the polyubiquitin chain, can result in different outcomes ranging from protein degradation to changes in the localization and/or activity of modified protein. Three enzymes sequentially catalyze the ubiquitination process: E1 ubiquitin-activating enzyme, E2 ubiquitin-conjugating enzyme, and E3 ubiquitin ligase. E3 ubiquitin ligase determines substrate specificity and, therefore, represents a very interesting study subject. Here we present a comprehensive approach to study the relationship between the enzymatic activity and function of the RING-type E3 ubiquitin ligase. This four-step protocol describes 1) how to generate an E3 ligase deficient mutant through site-directed mutagenesis targeted at the conserved RING domain; 2&#8211;3) how to examine the ubiquitination activity both in vitro and in planta; 4) how to link those biochemical analysis to the biological significance of the tested protein. Generation of an E3 ligase-deficient mutant that still interacts with its substrate but no longer ubiquitinates it for degradation facilitates the testing of enzyme-substrate interactions in vivo. Furthermore, the mutation in the conserved RING domain often confers a dominant negative phenotype that can be utilized in functional knockout studies as an alternative approach to an RNA-interference approach. Our methods were optimized to investigate the biological role of the plant parasitic nematode effector RHA1B, which hijacks the host ubiquitination system in plant cells to promote parasitism. With slight modification of the in vivo expression system, this protocol can be applied to the analysis of any RING-type E3 ligase regardless of its origins.

The goal of this manuscript is to present an outline for the comprehensive biochemical and functional studies of the RING-type E3 ubiquitin ligases. This multistep pipeline, with detailed protocols, validates an enzymatic activity of the tested protein and demonstrates how to link the activity to function.

אפיון פונקציונלי של מסוג הטבעת E3 ליגטיות בתוך מבחנה ובפלאנטה

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and atherosclerosis. Although there are several methods for analyzing plasma lipoproteins, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Because of its intact separation procedure, the lipoprotein fractions isolated by this method can be used for analysis of lipoproteins, apolipoproteins, proteomes, and functional study of lipoproteins with cultured cells in vitro. Here, we provide a detailed protocol to isolate seven lipoprotein fractions including VLDL (d&#60;1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDLs (d=1.04 and 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1.10, and 1.21 g/mL) from rabbit plasma using sequential floating ultracentrifugation. In addition, we introduce the readers how to analyze apolipoproteins such as apoA-I, apoB, and apoE by SDS-PAGE and Western blotting and show representative results of lipoprotein and apolipoprotein profiles using hyperlipidemic rabbit models. This method can become a standard protocol for both clinicians and basic scientists to analyze lipoprotein functions.

Several methods have been used for analyzing plasma lipoproteins; however, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Here, we describe a method regarding how to isolate lipoproteins from plasma using sequential density ultracentrifugation and how to analyze the apolipoproteins for both diagnostic and research purposes.