ייצור חלקיקי שומנים טעונים siRNA באמצעות מכשיר מיקרופלואידי

גודל חלקיקי השומנים משפיע על הייחוס הביולוגי, אפקט אנטי הגידול, וביצועי השתקת גנים. לכן, שיטת בקרת גודל LNP היא טכניקה יעילה לייצור תרופות ננו, כולל מערכות אספקת RNA. מכשיר מיקרופלואידי מקורי זה, בשם מכשיר iLiNP, היה מסוגל לשלוט בגודל LNP הנע בין 20 ל 100 ננומטר במרווחי 10 ננומטר.

מכשיר iLiNP יכול לייצר לא רק LNPs טעון siRNA, אלא כל mRNA טעון LNPS, ו ribonucleoprotein טעון LNPs. כדי להתחיל, לקחת את פתרונות האתנול השומנים ולהפיק את siRNA טעון LNPs על ידי ערבוב DOTAP, DSPC, כולסטרול ופתרונות DMG-PEG2k ביחס טוחן של 50 כדי 10 כדי 38.5 כדי 1.5. התאם את ריכוז השומנים הכולל לשמונה מילימולר.

לאחר מכן לקחת את הפתרונות מימיים של 154 מילימולרי תמיסת מלח ו 25 מילימולר אצטט חוצץ ב pH 4 ולסנן אותם דרך מסנני קרום 0.2 מיקרומטר או מסנני מזרק. הכן את פתרון מאגר siRNA על ידי המסת 70 מיקרוגרם של siGL4 לתוך מיליליטר אחד של 25 מילימולר מאגר אצטט. מלא מזרקי זכוכית מיליליטר אחד עם שומנים בדם ופתרונות מימיים, בהתאמה.

חבר את מזרקי הזכוכית אל נימי השיא באמצעות מחברי מזרק, ולאחר מכן הגדר את קצב הזרימה של השומנים ואת פתרונות מימית ולהציג את השומנים ואת פתרונות מימית בנפרד לתוך המכשיר iLiNP באמצעות משאבות מזרק. לאסוף את ההשעיות LNP במיקרו-צינור מהשקע של מכשיר iLiNP. Dialyze ההשעיה LNP באמצעות קרום דיאליזה של 12 עד 14 קילודלטון קיצוצים במשקל מולקולרי בארבע מעלות הוא צלזיוס לילה נגד מלוחים או DPBS עבור POPC LNPs ו- SIRNA טעון LNPs, בהתאמה.

לאסוף את ההשעיות LNP שעברו דיאליזה במיקרו-צינוריות ולאחר מכן לשפוך 20 עד 30 מיקרוליטרים של ההשעיה LNP לתא מיקרו קוורץ. לבסוף, למדוד את גודל LNP, התפלגות גודל LNP ומדד פיזור פולי על ידי פיזור אור דינמי. התפלגות גודל POPC LNP המיוצרת בתנאי זרימה שונים, כגון קצב הזרימה הכולל ויחסי קצב הזרימה מוצגים כאן.

גדלי LNP מדויקים הנעים בין 20 ל 100 ננומטר ניתן לשלוט באמצעות מכשיר iLiNP זה. LNPs בגודל קטן נוצרים בתנאי קצב זרימה כולל גבוה. בנוסף, גדלי ה- LNP הנוצרים ב- FRR 5 קטנים מאלה של FRR 3, ללא קשר לקצב הזרימה הכולל.

התפלגות גודל של רכיבי LNPs נטענים של siRNA מוצגת כאן. siRNAs הם encapsulated לתוך LNPs על ידי אינטראקציה אלקטרוסטטית בין DOTAP השומנים הקטיוניים siRNAs טעון שלילית. מכשיר iLiNP ייצר 90 ננומטר siRNA טעון LNPs קטיוני עם התפלגות צרה.

יעילות אנקפסולציה siRNA היה 95% בגלל האינטראקציה האלקטרוסטטית בין השומנים הקטיוניים לבין siRNAs טעון שלילית. ציטוטוקסיות ופעילות השתקת הגנים של 19 ננומטר siRNA טעון LNPs הוערכו. siRNA טעון LNPs הראה ציטוטוקסיות במינון של 10 עד 100 siRNA ננומולרי.

רמת הביטוי של לוציפראז ירדה בהתאם לריכוז siRNA. ה- LNPs הטעון siRNA הדחיק 80% ביטוי לוציפראז במינון של 100 siRNA ננומולרי. מיטובים של תנאי הזרימה הם השלבים החשובים ביותר בפרוטוקול כדי להשיג את LNPs בגודל הרצוי.

שיטת הייצור LNP המבוססת על מיקרופלואידים, כולל התקן iLiNP, אינה דורשת הליך מסובך וצפויה להיות מועסקת כשיטת הייצור הסטנדרטית של LNP.