Производство липидных наночастиц, нагруженных siRNA, с помощью микрофлюидного устройства

Размер наночастиц липидов влияет на биораспределение, противоопухолевый эффект и эффективность глушения генов. Таким образом, метод контроля размера LNP является эффективным методом получения нанопрепаратов, включая системы доставки РНК. Это оригинальное микрофлюидное устройство, названное устройством iLiNP, было способно контролировать размер LNP в диапазоне от 20 до 100 нанометров с интервалом 10 нанометров.

Устройство iLiNP может производить не только LNP, нагруженные siRNA, но и все LNPS, нагруженные мРНК, и LNP, загруженные рибонуклеопротеином. Для начала возьмите растворы липидного этанола и получите растворы LNP, загруженные siRNA, путем смешивания растворов DOTAP, DSPC, холестерина и DMG-PEG2k с молярным соотношением от 50 до 10 до 38,5 до 1,5. Отрегулируйте общую концентрацию липидов до восьми миллимоляров.

Затем берут водные растворы 154 миллимолярного физиологического раствора и 25-миллимолярного ацетатного буфера при рН 4 и фильтруют их через мембранные фильтры 0,2 микрометра или шприцевые фильтры. Готовят буферный раствор siRNA, растворяя 70 мкг siGL4 в одном миллилитре 25-миллимолярного ацетатного буфера. Наполните один миллилитр стеклянных шприцев липидными и водными растворами соответственно.

Соедините стеклянные шприцы с пиковым капилляром с помощью шприцевых разъемов, затем установите скорость потока липидных и водных растворов и введите липидные и водные растворы отдельно в устройство iLiNP с помощью шприцевых насосов. Соберите суспензии LNP в микропробирку с выходного отверстия устройства iLiNP. Диализируйте суспензию LNP с использованием диализной мембраны от 12 до 14 килодальных отсечек молекулярной массы при четырех градусах Цельсия в течение ночи против физиологического раствора или DPBS для POPC LNP и siRNA,нагруженных LNP, соответственно.

Соберите диализированные суспензии LNP в микротрубки, а затем пипеткой от 20 до 30 микролитров суспензии LNP в микрокварцевую ячейку. Наконец, измерьте размер LNP, распределение LNP по размерам и индекс полидисперсности динамическим рассеянием света. Здесь показано распределение по размерам POPC LNP при различных условиях потока, таких как общий расход и коэффициенты расхода.

Точные размеры LNP в диапазоне от 20 до 100 нанометров можно контролировать с помощью этого устройства iLiNP. Малогабаритные LNP формируются при высоких условиях общего расхода. Кроме того, размеры LNP, которые образуются на FRR 5, меньше, чем у FRR 3, независимо от общего расхода.

Распределение размеров нагруженных миРНК LNP показано здесь. siRNAs инкапсулируются в LNP путем электростатического взаимодействия между катионным липидом DOTAP и отрицательно заряженными siRNAs. Устройство iLiNP производило 90-нанометровые сиРНК-нагруженные катионные LNP с узким распределением.

Эффективность инкапсуляции siRNA составила 95% из-за электростатического взаимодействия между катионным липидом и отрицательно заряженными siRNAs. Оценивали цитотоксичность и активность глушения генов 19-нанометровых LNP, нагруженных сиРНК. сиРНК-нагруженные LNP показали цитотоксичность в дозе от 10 до 100 наномолярных siRNA.

Уровень экспрессии люциферазы снижался в зависимости от концентрации siRNA. LNP, нагруженные siRNA, подавляли экспрессию люциферазы на 80% в дозе 100 наномолярных siRNA. Оптимизация условий потока является наиболее важным шагом в протоколе для получения LNP желаемого размера.

Метод производства LNP на микрофлюидной основе, включая устройство iLiNP, не требует какой-либо сложной процедуры и, как ожидается, будет использоваться в качестве стандартного метода производства LNP.