כאן, אנו מספקים זרימת עבודה הכוללת את שיטת הביואינפורמטיקה הטובה ביותר לביצוע הניסויים כדי להעריך את ההשפעה של גלייפוסט על מיקרוביום. היתרון העיקרי הוא שהוא מספק השערה חזקה הניתנת לבדיקה לניסויי שדה ומעבדה עתידיים. ניתן ליישם את המתודולוגיה המתוארת במגוון מערכות, כולל צמחים, בעלי חיים ומיקרובים.
כל חלק של המתודולוגיה הוא די פשוט. אולי החלק המאתגר ביותר הוא לשלב צוות רב תחומי המסוגל לבצע חלקים שונים של העבודה. מי שידגים את ההליך יהיה סוני מתיו, חוקר מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל את הניסוי הראשון על ידי חלוקת שדה הניסוי ל -10 שכפולים של שליטה וטיפול GBP עם רצועות חיץ של צמחייה בין החלקות. טפלו בחלקות הבקרה במי ברז ובחלקות ליש"ט עם ליש"ט מסחריות כדי לחקות את מינון הגלייפוסט המרבי המותר בשיטות חקלאיות. דגימת המיקרוביוטה מצמחי ניסוי.
לאסוף 10 שכפולים של דגימות הצמח מהשדה, מיד להניח אותם על קרח ולהביא אותם למעבדה לעיבוד נוסף. לניסוי השני, אספו מצעים, כולל שבבי עץ, צואה וחלק מהמזון שנשפך משליו שניזון ממזון מזוהם ב-GBP או מזין מבוקר בניסוי של 12 חודשים בכלובים. שלח את דגימות המצעים למעבדה מוסמכת למדידות ריכוז הגלייפוסט מיד לאחר התפשטותו.
לשתול עשב רב שנתי וצמחי תות בכל חלקת אדמה כדי לחקור את המיקרוביוטה של השורש והעלים שלהם. זהה והסר את המיקרובים האנדופיטיים על ידי שטיפה ועיקור של דגימות הצמחים. לאחר עיקור הדגימות, יש לחלץ דנ"א גנומי באמצעות ערכת מיצוי דנ"א צמחית זמינה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
באמצעות גישה מקוננת, הגבר את האזורים המשתנים V6 עד V8 של הגן 16S rRNA ועשה תערובת מאסטר PCR עבור מספר הדגימות הנדרש כמתואר בכתב היד של הטקסט. עבור הסיבוב הראשון של PCR, השתמש בפריימרים 799 קדימה ו- 1492 לאחור. הגדר את פרופיל ההגברה בתרמוצילר למשך 35 מחזורים.
כדי לאמת את ההגברה, בצע אלקטרופורזה באמצעות חמישה מיקרוליטרים של מוצר מוגבר ולאחר מכן דילל את 25 המיקרוליטרים הנותרים של מוצר ה- PCR במים אולטרה-אפורים אוטוקלאבים ביחס של אחד ל -10. באמצעות הפריימרים האוניברסליים 1062 קדימה ו-1390 לאחור, ערכו את הסיבוב השני של ההגברה עם 25 מחזורים. דיללו את מוצרי ה-PCR המתקבלים במים אולטרה-פורים אוטוקלאבים ביחס שווה.
בצע את הסיבוב השלישי של הגברה עם שמונה מחזורים כדי לתייג את המוצרים עם הברקודים ורצף המתאמים P1. אמתו את הריכוז באיכות של מוצרי PCR על ביואנליזר ואגדו את הנפחים המרכיבים 30 ננוגרם של דנ"א של כל דגימה בצינור 1.5 מיליליטר כדי להכין ספריית שוויון. בחר את האמפליקונים בגודל 350 עד 550 זוגות בסיסים לפי פיצול גודל באמצעות מערכת אוטומטית לבחירת גודל DNA על קלטת ג'ל אגרוז.
אספו את ה-elute המכיל את האמפליקונים בגודל שצוין לתוך בקבוקון בקלטת והתוצאה היא ספריית גנים מטוהרת של 16S rRNA. מעבירים את האלואנט שנאסף לתוך צינור 1.5 מיליליטר ומוודאים את הטוהר והריכוז בביואנליזר. דיללו את ספריית הדנ"א באמצעות מים אולטרה-פוריים אוטו-חלביים לריכוז סופי של 26 פיקומולארים.
כדי להגביר את אזור ITS, לאחר הגדרת התגובה עם פריימרים של ITS, הגדר את פרופיל ההגברה על התרמוציקלר. לאחר מכן לנתח חמישה מיקרוליטרים של המוצר המוגבר על 1.5% ג'ל אגרוז ולדלל את 25 המיקרוליטרים הנותרים של המוצר ביחס של אחד עד 10 באמצעות מים אולטרה-אפורים אוטוקלבים. צור תערובת מאסטר PCR עבור מספר הדגימות הנדרש עם פריימרים קדמיים המתויגים בברקוד ופריימרים הפוכים המתויגים על-ידי מתאם P1.
באמצעות מוצר ה-PCR המדולל כתבנית, בצעו את הסבב השני של ההגברה. בדומה להכנת הספרייה לגן 16S rRNA, הכינו את הספרייה לאזור ITS המטוהר. ליזום את ניתוחי הביואינפורמטיקה של רצף החלבון EPSPS.
הערך את הרגישות הפוטנציאלית של רצף השאילתה לגלייפוסט מהשרת בתנאי פלטים שבהם הפלט מציג את החלק של סמני חומצות האמינו הקיימים ברצפי השאילתה ואת מספר המוטיבים. פלט שניים מציג יישורים של השאילתה ורצפי ההפניה המבוססים על שאריות סמן. פלט שלוש מציג יישורים זוגיים מלאים של רצפי השאילתה וההפניות.
פלט 4 מראה רצפי ייחוס EPSPS של ויבריו כולרה, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis, ו- Streptomyces davawensis. בסוף דף הפלט, מצא קישורים לכלים חיצוניים כגון BLASTp ותחומים שמורים כדי לנתח עוד יותר את רצף EPSPS של השאילתה. לאחר זיהוי רצפי EPSPS מהמאגרים הציבוריים, גש לערכות נתונים אלה מהדף הראשי של שרת מחלקת EPSPS המכיל מידע טקסונומי וממחלקת EPSPS של מעל 50, 000 רצפים.
שקלו את הביומסה מעל פני הקרקע של הצמחים בסוף עונת השדה כדי להשוות את צמיחת הצמחים בליש"ט ולשלוט בחלקות. בגיליון אלקטרוני, מיפו את ה-OTUs החיידקיים עבור ניסויי מיקרוביום לתוך מערכי נתונים מחושבים מראש. ועל סמך ציון הסתברותי, חשב את הרגישות הפנימית לגלייפוסט.
שיטה זו שימשה לכימות שינויים ברגישות בחלבון EPSPS ברמה מיקרו-אבולוציונית. זיהינו שינויים במצב הרגישות ב-12 מתוך 32 קבוצות קרובות של פרוקריוטים שנותחו. לפיכך, השימוש הרציף במוצרים מבוססי גלייפוסט עשוי לייצר דיסביוזה מיקרוביאלית במיקרוביום של צמחים, בעלי חיים וקרקע.
ודא את האיכות של הליכים לפני ואחרי PCR כדי להשיג ספריות אמפלייקון אופטימליות. כמו כן, ודא שרצף החלבון EPSPS אינו חלקי לפני השימוש בתוכנה. בניסויי שדה, הקפידו למנוע זיהום של בקרות עם גלייפוסט.
