ניתוח ציטומטרי של זרימה של פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם ונגזרותיהם העצביות והגליליות

הפרוטוקול שלנו מספק למדען כלי רב עוצמה לשילוב מספר פרמטרים זעירים ברמת התא הבודד מה-IPS האנושי ונגזרותיו העצביות והברורות. פרוטוקולים אלה מאפשרים שילוב של פרמטרים מיטוכונדריאליים, הן ברמה הכוללת והן ברמה הספציפית לכל נפח מיטוכונדריאלי, באמצעות ציטומטריה של זרימה. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מספר סוגי תאים כולל אלה ממחלות נוירודגנרטיביות אחרות.

לכן, הוא יכול בכך לעזור לספק תובנה לגבי המנגנונים שמאחורי סוגי מחלות אלה וגם עשוי לסייע בסינון טיפולי. כדי להתחיל, זרעו את התאים בנפרד לארבע בארות בצלחת של שש בארות ודגרו על התאים עד להשגת 50 עד 60% מפגש. בסוף תקופת התרבית, הכינו חמש תמיסות צביעה אישיות המכילות שילובים שונים של מדיום תרבית, FCCP, TMRE, MTG וממרח גרב מיטו.

הוסיפו אותם לבארות המתאימות, ודגרו את התאים כמתואר בכתב היד. לאחר מכן, לשאוף את המדיום מכל הבארות לשטוף עם PBS. עבור ניתוק תאים, דגירה של התאים עם מיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה של תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

נטרל את מגיב הדיסוציאציה של התא עם מיליליטר אחד של DMEM, בתוספת 10% FBS. לאחר מכן אסוף את תוכן הבאר בצינור כרוניקה של 15 מיליליטר. גלולה במורד התאים על ידי צנטרציה ושטפו את כדור התא עם PBS פעם או פעמיים.

לשאוף את כל supernatant, משאיר כ 100 microliters בצינור. להשעות מחדש את כדורי התא ב 300 מיקרוליטר של PBS. לאחר העברת השעיית התא לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר, לשמור את הצינור בחושך בטמפרטורת החדר.

נתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה עם הגדרות מסנן מעבר הפס המתוארות בכתב היד של הטקסט. יש לנתק כמיליון תאים באמצעות מגיב הדיסוציאציה של התא ולהוריד את התאים כפי שהוכח קודם לכן. נטרל את תרחיף התא עם DMEM בתוספת 10% FBS ואסוף את המתלה בצינור 15 מיליליטר.

לתקן את התאים עם מיליליטר אחד של 1.6% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. Permeabolize את התאים עם מיליליטר אחד של קרח קר 90% מתנול במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן לחסום את הדגימות במיליליטר אחד של חיץ חוסם, ולשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה עם PBS, כפי שהודגם.

כדי לזהות קומפלקסים ותת-יחידות מיטוכונדריאליות שונות, דגרו על התאים במשך 30 דקות עם הנוגדנים הראשוניים המתוארים בכתב היד של הטקסט. לאחר שטיפת התאים פעם אחת עם PBS, לדגור על התאים עם נוגדן משני במשך 30 דקות. בתום הדגירה, יש לשטוף ולהשעות מחדש את התאים וה-PBS כפי שהוכח.

מעבירים את מתלה התאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה בקוטר 1.5 מיליליטר, המוחזק בחושך על קרח. לאחר מכן, לנתח את התאים על ציטומטר זרימה ולזהות אותות ולסנן אחד באמצעות 5 30/30 פס לעבור מסנן. עבור כל תת-אוכלוסייה של תאים, בחר תרשים היסטוגרמה ונתח את עוצמת הפלואורסצנציה החציונית או MFI של ערוצי הסינון השונים.

חשב את רמות TMRE, ערכים ספציפיים עבור תת-יחידה מורכבת של MMP ROS ו- TFAM, כמתואר בכתב היד של הטקסט. ציטומטריה של זרימה ותאים חיים שימשו לחקר נפח מיטוכונדריאלי MMP ורמות ROS. בתאי עצב מסוג POLG DA נצפו MMP ספציפי נמוך יותר ו-ROS ספציפי גבוה יותר, בעוד שלא נצפו שינויים בנפח המיטוכונדריה, סך ה-MMP וה-ROS.

האסטרוציטים של POLG ירדו ב-MMP, אך לא חל שינוי בנפח המיטוכונדריה וב-ROS. ציטומטריה של זרימה ותאים קבועים שימשו כדי לחקור את הרמה של תת-יחידה מורכבת MRC ו- TFAM. תאי עצב של DA הראו עלייה ב-COMPLEX 1 וב-TFAM לעומת שליטה, אך לא חל שינוי בשתי רמות מורכבות.

אסטרוציטים של POLG הראו הפחתה של קומפלקס אחד ארבע ו- TFAM ספציפי. מכיוון שצפיפות התא יכולה להשפיע גם על MMP ועל הקשר בין MTG לפלואורסצנציה של MMP, זהו ספציפי לתא. התאמת פרוטוקול זה לסוגי תאים אחרים תדרוש ככל הנראה אופטימיזציה בעקבות הליך זה, ניתן לבצע אסיס מבוסס מיקרוסקופי, למשל מיקרוסקופיה קונפוקלית, המספקת פרטים נוספים על מבנים מיטוכונדריאליים.

לכן, בעוד שאסטרטגיה זו מזהה תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בתאי עצב DA ובאסטרוציטים ממחלה מיטוכונדריאלית ידועה, ניתן ליישם טכניקות אלה גם כדי לחקור את תפקוד המיטוכונדריה בכל סוג של תאים ומחלות.