תפקוד מיטוכונדריאלי ביסוד מחלות ניווניות רבות. הפרוטוקול שלנו מספק כלי חשוב לבחינת הדינמיקה המיטוכונדרית באקסונים, ומקל על חקר מחלות נוירולוגיות המערבות ניוון אקסונאלי. על ידי שילוב של תיוג מיטוכונדריאלי, הדמיית תאים חיים וטכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטית המושרה הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי לאפיין סחר מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים אנושיים ולנתח את המטומטמים שלהם.
תחבורה מיטוכונדרית לקויה ומורפולוגיה ניתן לראות בתרבויות תאי גזע ומודלים של בעלי חיים של מחלות ניווניות מתן מטרות טיפוליות פוטנציאליות לטיפול במחלות אלה. לאחר יום שלושים וחמש של תרבות, לנתק את הנוירוזפרות נבדל מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם לתוך אשכולות קטנים עם 1 מ"ג / מ"ל של פתרון ניתוק תאים במשך שתי דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה לאסוף את אשכולות התא על ידי צנטריפוגה ו resuspend את גלולה במיליליטר אחד של NDM.
צלחת על חמישה אשכולות של תאים במאה microliters של בינוני לכל פוליאורניתאין ו לקטוז דהידרוגנאז מרומם את מגרצת ממברנת מרתף מקף ללא וירוס מצופה 35 מילימטר זכוכית התחתון כלים. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של NDM בתוספת B27, מונופוספט אדנוזין מחזורי, גורם גדילה דמוי אינסולין, גורם נוירוטרופי המופק על ידי המוח האנושי וגורם נוירוטרופי הנגזר מתא גליה לכל תרבות. כדי לדמיין מיטוכונדריה לאורך האקסונים של נוירונים forebrain הראשון להכתים את הנוירונים עם 50 צבע פלואורסצנטי אדום nanomolar ב NDM במשך שלוש דקות ב 37 מעלות צלזיוס ואחריו שתי שטיפות NDM חם.
לאחר מכן, מקם את התרבות על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ובחר את המטרה 40X. תחת שדה הפאזה זהה את האקסונים בהתבסס על המאפיינים המורפולוגיים שלהם. כדי להבחין בכיוון התנועה המיטוכונדרית לאורך האקסונים לזהות בבירור את גופי התא של נוירונים.
לאחר הבחנה גוף התא האקסון להתאים את זמן החשיפה ואת המוקד של המיטוכונדריה האקסונים וללכוד את התחבורה המיטוכונדרית בתוך האקסונים כל חמש שניות במשך חמש דקות בסך הכל. כדי לנתח הובלה מיטוכונדרית ב ImageJ לפתוח פיג'י ובחר את תוסף ביו פורמטים. השתמשו ביבואן Bio-Formats כדי לייבא את התמונות של סדרת tiff ולבחור ImageJ רגיל ולפתוח את כל הסדרות.
בדקו ערוצים מפוצלים בקנה מידה אוטומטי ולחצו על הלחצן 'אשר' כדי לציין את מספר המסגרת ואת גודל התמונות בפיקסלים. לאחר התאמת הבהירות והניגודיות של כל 60 המסגרות, השתמש בקו מקובע כדי למתוח קו מגוף התא לאקסון המסוף. ליצירת הקימוגרף בחרו בתוסף Kymograph המרובים ובחרו ברוחב הקו.
כדי למדוד את המרחק, ערכי הזמן והמהירות עבור המיטוכונדריה הנעה הפתוחה tsp050607. txt בתוסף פקודות המאקרו. ולצייר קו מקופל מעל עקבות התנועה המיטוכונדרית על הקימוגרף מהממונה על האזור הנחות.
לאחר ציור הקו לפתוח מהירות קריאה מ- tsp בתוסף פקודות המאקרו כדי לקרוא את המהירויות מקולחות המתאימות לקו. לאחר מכן פתחו את התמונה המקורית ולהשתמש בכלי הקו כדי לצייר קו לאורך סרגל קנה המידה. בחר ניתוח כדי למדוד את אורך הקו ולהמיר את ה- dx כעת ואת יחידות המרחק מפיקסלים למיקרומטרים.
לאחר מכן שנה את השעה מפיקסלים לשתיים. כדי לנתח את האורך המיטוכונדריאלי ואת האזור בתוך אקסונים ב ImageJ להתקין את תוסף מקף תחתון מקף תחתון ליישר JAR ולפתוח את תמונת האקסון של עניין. המירו את התמונה של 32 סיביות לשמונה סיביות ולהשתמש בכלי קו מקובע כדי לעקוב אחר האקסון.
בחר את תוסף JAR מקף תחתון ישר ולהגדיר את רוחב קו רחב של תריס ל 50 פיקסלים. עקבו שוב אחר האקסון כדי ליצור אקסון מיישר ולהתאים את סף התמונה. בחרו 'ניתוח מדידות מוגדרות היקפיות מתאימות לאליפסה ולתארי צורה' כדי לקבוע את המדידה ולהשתמש בפונקציית הקו כדי למדוד את סרגל קנה המידה בתמונה המקורית כפי שהוכח.
תחת ניתוח ולהגדרת קנה מידה הזן את המרחק במרחק הידוע של הפיקסלים ואת יחידת האורך כדי לקבוע את קנה המידה. לאחר מכן בחרו 'כללי' כדי להגדיר את הגדרת קנה המידה לכל התמונות. לבסוף בחר לנתח ולנתח חלקיקים כדי לקבוע את האזור ובחר תוצאות תצוגה כדי להציג את המדידה המתקבלת.
לאחר בידול לתוך נוירונים גלוטמטרגיים telencephalic התאים יכולים להיות מאופיינים על ידי T-B-R שלהם אחד בטא שלוש ביטוי סמן tubulin. כתמים בצבע פלואורסצנטי אדום והדמיה לשגות בזמן מאפשר הערכה של התחבורה האקסונאלית של המיטוכונדריה. מיטוכונדריה אחת יכולה להישאר סטטית או לנוע בכיוון אנטרוגרדי או מדרדר בתוך אקסון.
את מהירות התנועה המיטוכונדרית לאורך האקסון ניתן לכמת כפי שמודגם. לדוגמה באמצעות תוכנת ניתוח מסחרית זמינה אחוז המיטוכונדריה מוטיב מופחת באופן משמעותי נוירונים S-P-G-3-A בהשוואה נוירונים סוג הבר. כדי לנתח את אורך האזור המיטוכונדריאלי ואת יחס הגובה-רוחב אקסונים יכולים להתיישר בתוכנת ניתוח התמונה ונבחרים על-ידי התאמת הסף.
לאחר מכן ניתן לקבל את רוחב אורך ההיקף של אזור המיטוכונדריה ויחס הגובה-רוחב מהאקסון המיישר. לדוגמה, הן אורך המיטוכונדריה והן יחס הגובה-רוחב מופחתים באופן משמעותי באקסונים של נוירונים מסוג S-P-G 15 בהשוואה לשליטה באקסונים מסוג בר. חשוב לחמם את המדיום ואת חממת המיקרוסקופ לשטוף את התאים בעדינות ולאפשר לתאים להתייצב במשך עשרים דקות לפני ההדמיה.
לאחר הדמיה של תאים חיים ניתן לתקן את התרבויות ולהעפוף לכשל חיסוני כדי לבחון את הביטוי של חלבונים אחרים בעלי עניין. מאתגר לבחון את הדינמיקה המיטוכונדרית בעצבים אנושיים חיים. טכניקה זו מספקת את הכלי הייחודי לחקר הדינמיקה המיטוכונדרית והתנוונות העצבים במחלות נוירולוגיות.
