פרוטוקול זה מאפשר לכמת רמות ודינמיקה של מתילציה של ארגינין. שינוי זה ממלא תפקידים רגולטוריים חשובים ויכול לשמש סמן ביולוגי למחלות. היתרון של שיטה זו הוא שהיא מספקת זרימת עבודה פשוטה למספר כמעט בלתי מוגבל של מטריצות החל תאים, מדיה, לרקמות ונוזלים ביולוגיים.
מתילציה של ארגינין מוגברת בסוגי סרטן רבים בבני אדם והמעכבים הראשונים של טרנספראזות שיטת ארגינין נבדקים בניסויים קליניים. שיטה זו יכולה לסייע בריבוד החולים ובהערכת הסיכונים. מי שידגים את ההליך יהיה הנסיורג האביש, טכנאי מחקר מהמעבדה שלי.
עבור דגימות נוזליות, להוסיף 400 מיקרוליטר של מתנול קר כקרח ל 200 מיקרוליטר של הדגימה ולאחר מכן דגירה במשך 30 דקות במינוס 20 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה מדגם זה ב 10, 000 גרם במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הזיזו את הסופרנאטנט ואספו את הגלולה בצינורות של 1.5 מיליליטר.
עבור חומרים מוצקים, יש להוסיף 600 מיקרוליטר של 66% מתנול מים לצינורות עיסה המכילים 30 עד 60 מיליגרם של רקמה או כדורי תאים. הומוגניזציה של הרקמה הרכה פעם אחת למשך 20 שניות ושל הרקמה הנוקשה פעמיים למשך 20 שניות עם מרווח של חמש דקות ביניהם. מניחים מיד את הדגימה על קרח ומעבירים את כל הליזט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר, ואחריו דגירה.
לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב 10, 000 G במשך 30 דקות. בארבע מעלות צלזיוס, בחר את הסופרנאטנט בצינורות של 1.5 מיליליטר והמשך עם הידרוליזה של חלבון באמצעות סופרנטנט זה. חותכים את המכסות של כל צינור.
לאחר מכן להוסיף 500 מיקרוליטר של תשע חומצה הידרוכלורית מולרית לכל דגימה. לבסוף, הכניסו את הצינורות לצינורות זכוכית. סגרו אותם היטב עם מכסים, כדי להבטיח איטום מתאים, והניחו את הצינורות הללו בתוך זכוכית מלאה חלקית בחול.
הידרוליזה של הדגימות במשך 16 שעות בטמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס בתא ייבוש. מצננים את הדגימות ומבצעים להן ליופיליזציה למשך הלילה באמצעות צנטריפוגת ואקום גבוהה. למחרת, ממיסים כדורים מיובשים לחלוטין במיליליטר אחד של 0.1 חומצה הידרוכלורית מולרית.
הוסף 50 מיקרוליטר כלורופורם לכל צינור והמיס היטב את הגלולה באמצעות פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר. מעבירים את הנפח המלא לצינור חדש וצנטריפוגות את הדגימות למשך 10 דקות. בזהירות לאסוף את השלב העליון של נוזל biphasic בצינור חדש.
השתמש בצינורות פלסטיק למיצוי ידני או צינורות זכוכית לחילוץ פאזה מוצקה רובוטית. לחילוץ ידני בפאזה מוצקה, התנה מראש את המחסניות בכל הפעלה ולאחר מכן צנטריפוגה בת דקה. לאחר מכן, טען את הדגימה על מחסניות SPE וצנטריפוגר אותם ב 600 G במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.
שטפו את המחסניות במיליליטר מים שלוש פעמים, כל שטיפה ואחריה צנטריפוגה למשך דקה. לאחר מכן לשטוף חמש פעמים עם מיליליטר אחד של 0.1 חומצה הידרוכלורית מולרית, ואחריו צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 800 גרם בטמפרטורת החדר. שטפו את המחסניות פעמיים עם מיליליטר אחד של מתנול ואחריו צנטריפוגה במשך דקה אחת.
Elute arginine ונגזרותיו לתוך צינור 15 מיליליטר יחיד על ידי הוספת מיליליטר אחד של שלושה X פתרון חלופי צנטריפוגה פעמיים במשך דקה אחת. למיצוי פאזה מוצקה רובוטית, הניחו את הצינורות לאיסוף האלוטים ואת צינורות הזכוכית המכילים את השלב העליון של הנוזל הדו-פאזי למיקום המתאים של הרובוט. השתמש ביישום או בשיטה בתוכנה בהתבסס על השלבים המתוארים עבור SPE ידני.
Lyophilize הדגימות לילה להתייבש לחלוטין כדי להיפטר אמוניה ומים. ממיסים כל דגימה ב-500 מיקרוליטר של מאגר NMR עד שהיא הופכת הומוגנית. לאחר מכן העבירו כמות שווה של דגימה הומוגנית לכל צינור NMR.
ספקטרום J-RES של הידרוליזה של חלבון שמרים מטוהרים באמצעות פרוטוקול SPE מוצגים כאן. שינויים כימיים אופייניים שונים יכולים להבחין בין L-ארגינין ו-ADMA ב-3.25 ו-3.02 חלקים למיליון. ניתן להפריד ולכמת את שני החומרים במטריצה תאית.
בהתבסס על מספר הפרוטונים של קבוצת המתיל או המתילן הספציפית בשינוי הכימי המתאים, ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית H אחת מאפשרת כימות מדויק. באמצעות גישה זו, ניתן להפריד ולכמת את השינויים הכימיים בתהודה מגנטית גרעינית H של SDMA ו-MMA על ידי שינויים כימיים אופייניים ב-2.76 חלקים למיליון SDMA ו-2.74 חלקים למיליון MMA. בעת ביצוע פרוטוקול זה, לאסוף בזהירות את השלב העליון של נוזל biphasic המכיל את החלק מסיס במים עם פיפטה ולהעביר אותו צינורות חדשים.
השתמש בצינורות 1.5 מיליליטר עבור SPE ידני או זכוכית מחלקה עבור SPE רובוטי. יש להימנע מזליגה על הכלורופורם ותכולתו. האלואטים המכילים ארגינין ומיני הארגינין שעברו מתילציה מנותחים באמצעות ספקטרוסקופיית NMR.
זה מניב כמויות מוחלטות של מינים אלה. הטכנולוגיה שלנו משמשת כיום בשפע של פרויקטים מחקריים בסיסיים שמטרתם לנתח את התפקיד הפתופיזיולוגי של מתילציה של ארגינין. יתר על כן, אנו מעריכים מתילציה של חלבון ארגינין כסמן ביולוגי מועמד במספר מחלות אנושיות.
