이 프로토콜은 아르기닌 메틸화의 수준과 역학을 정량화하는 것을 가능하게합니다. 이 변형은 중요한 조절 역할을하며 질병에 대한 바이오 마커 역할을 할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 세포, 배지에서 조직 및 생체 유체에 이르기까지 거의 무제한의 매트릭스에 대한 간단한 워크 플로우를 제공한다는 것입니다.
아르기닌 메틸화는 많은 인간 암에서 상승하며 아르기닌 방법 전이 효소의 첫 번째 억제제는 임상 시험에서 테스트됩니다. 이 방법은 환자의 계층화 및 위험 평가에 도움이 될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 기술자 인 Hansjorg Habisch가 될 것입니다.
액체 샘플의 경우 200 마이크로 리터의 샘플에 400 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 메탄올을 첨가 한 다음 섭씨 영하 20도에서 30 분 동안 배양합니다. 이 샘플을 섭씨 4도에서 30 분 동안 10, 000G에서 원심 분리합니다. 상청액을 옮기고 1.5 밀리리터 튜브에 펠릿을 모으십시오.
고체 물질의 경우 600 마이크로 리터의 66 % 메탄올 물을 30-60 밀리그램의 조직 또는 세포 펠릿이 들어있는 펄프 화 튜브에 첨가하십시오. 연조직을 20초 동안 1회 균질화하고 뻣뻣한 조직을 20초 동안 2회 균질화하고 그 사이에 5분 간격으로 균질화한다. 즉시 샘플을 얼음 위에 놓고 모든 용해물을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴 다음 배양하십시오.
이어서, 샘플을 10, 000 G에서 30분 동안 원심분리한다. 섭씨 4도에서 1.5 밀리리터 튜브에서 상청액을 선택하고이 상청액을 사용하여 단백질 가수 분해를 진행합니다. 각 튜브의 캡을 자릅니다.
그런 다음 각 샘플에 500 마이크로 리터의 9 몰 염산을 첨가하십시오. 마지막으로 튜브를 유리관에 넣습니다. 캡으로 단단히 닫고 적절한 밀봉을 보장하고이 튜브를 부분적으로 모래로 채워진 유리 비커에 넣으십시오.
샘플을 건조 챔버에서 섭씨 110도에서 16시간 동안 가수분해한다. 샘플을 냉각하고 고진공 원심 분리기를 사용하여 밤새 동결 건조하십시오. 다음날, 완전히 건조 된 펠릿을 0.1 몰 염산 1 밀리리터에 녹입니다.
각 튜브에 50 마이크로 리터의 클로로포름을 넣고 1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 펠렛을 완전히 용해시킵니다. 전체 부피를 새 튜브로 옮기고 샘플을 10분 동안 원심분리합니다. 조심스럽게 새 튜브에 이상성 액체의 상부 단계를 수집하십시오.
수동 용 플라스틱 튜브 또는 로봇 고체상 추출용 유리관을 사용하십시오. 수동 고체상 추출의 경우 모든 실행에서 카트리지를 사전 컨디셔닝한 후 1분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 샘플을 SPE 카트리지에 로드하고 실온에서 2분 동안 600G로 원심분리합니다.
카트리지를 1 밀리리터의 물로 3 번 세척 한 다음 1 분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 0.1 몰 염산 1 밀리리터로 5 회 세척 한 다음 실온에서 800G에서 1 분간 원심 분리합니다. 메탄올 1 밀리리터로 카트리지를 두 번 씻은 다음 1 분 동안 원심 분리합니다.
아르기닌과 그 유도체를 1 밀리리터의 3 X 교체 용액과 원심 분리기를 추가하여 단일 15 밀리리터 튜브에 1 분 동안 두 번 용리시킵니다. 로봇 고체상 추출의 경우 용출액 수집용 튜브와 이상성 액체의 상부 위상이 포함된 유리관을 로봇의 각 위치에 배치합니다. 수동 SPE에 대해 설명된 단계에 따라 소프트웨어에서 애플리케이션 또는 방법을 사용합니다.
암모니아와 물을 제거하기 위해 샘플을 밤새 동결 건조하여 완전히 건조시킵니다. 균질해질 때까지 각 샘플을 500 마이크로리터의 NMR 버퍼에 용해시킵니다. 그런 다음 동일한 양의 균질 샘플을 각 NMR 튜브로 옮깁니다.
SPE 프로토콜을 사용하여 정제된 효모 단백질 가수분해물의 J-RES 스펙트럼이 여기에 표시됩니다. 다른 특징적인 화학적 이동은 L- 아르기닌과 ADMA를 3.25 및 3.02ppm으로 구별 할 수 있습니다. 두 물질은 세포 매트릭스에서 분리되고 정량화 될 수 있습니다.
각각의 화학적 이동에서 특정 메틸 또는 메틸렌 그룹의 양성자 수를 기반으로 하나의 H 핵 자기 공명 분광법으로 정확한 정량화가 가능합니다. 이 접근법을 사용하면 SDMA와 MMA의 1H 핵자기 공명 화학적 이동을 2.76ppm SDMA 및 2.74ppm MMA의 특징적인 화학적 이동으로 분리하고 정량화할 수 있습니다. 이 프로토콜을 수행 할 때 피펫으로 수용성 분획을 함유 한 2 상 액체의 상부 단계를 조심스럽게 수집하여 새 튜브로 옮깁니다.
수동 SPE에는 1.5밀리리터 튜브를 사용하거나 로봇 SPE에는 클래스 유리를 사용하십시오. 클로로포름과 그 내용물을 흘리지 마십시오. 아르기닌 및 메틸화 아르기닌 종을 함유하는 용출액은 NMR 분광법을 사용하여 분석된다.
이것은 이러한 종의 절대량을 산출합니다. 우리의 기술은 현재 아르기닌 메틸화의 병태 생리 학적 역할을 해부하는 것을 목표로하는 수많은 기초 연구 프로젝트에 사용되고 있습니다. 또한, 우리는 단백질 아르기닌 메틸화를 여러 인간 질병의 바이오 마커 후보로 평가하고 있습니다.
