כתם גולגי מהיר להדמיית עמוד שדרה דנדריטי בהיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם-מצחית

למרות פשוט יחסית, טכניקת הספיגה Golgi יש כמה צעדים מסובכים כישלון לעשות אותם כראוי תוצאות בתאים שאינם מתאימים לניתוח. טכניקה זו מספקת תיוג מהיר, לשחזור של נוירונים ספוגים Golgi. בנוסף, השגיאה הסטנדרטית הקטנה של הממוצע מאפשרת השוואה בין ניסויים.

החלק המאתגר ביותר בטכניקה זו הוא חיתוך קטעי cryostat, כי יש עקביות וקיבעון יוצא דופן, ולכן מקבל אותם על שטוח שקופית הוא קצת אתגר לוקח בפועל. ראשית, מניחים כמות קטנה של רקמות בינוניות על צ'אק קריוסטט טרום מגניב. הר את בלוקי המוח על צ'אקים קריוסטט על ידי הפשרת צד אחד של הבלוק מעט ביד בכפפה והנחתו על מדיום הרקמה.

השתמש בתרסיס הקפאה על הסכין והבלוק. השתמשו בצלחת האנטי-רול או במברשת כדי לשמור על החלק שטוח בזמן החיתוך. חותכים 100 מקטעי מיקרומטר על קריוסטט במינוס 22 מעלות צלזיוס.

להפשיר הר, אם אפשר, באמצעות שקופית טמפרטורת החדר במהירות להתנגד לו לחלק. לחלופין, שמור שקופיות בהקפאה, כך שהם קופאים. מעבירים את המקטע עם מלקחיים קרים או מברשת צבע קרה ואז מפשירים את ההרכבה.

הר שלושה עד ארבעה חלקים קורונליים על שכך. נקו את הסכין עם מגבוני נייר בין הפרוסות. אם הסכין דורשת ניקוי נוסף, יש להשתמש ב-100% אתנול ולייבש לפני חיתוך הפרוסה הבאה.

מקם שקופיות בארון תקשורת, מרווחים מספיק כדי לאפשר גישה לפתרון למקטעים. מניחים חלקים במים מזוקקים פעמיים במשך ארבע דקות לפני שמכניסים אותם לפתרון הספיגה של גולגי למשך 10 דקות. הפרד את פתקי הכיסוי כדי להבטיח רק פתק כיסוי אחד ממוקם על המקטעים.

מכסים את מגלשות הזכוכית בכמות נדיבה של מדיום הרכבה לפני הנחת פתק כיסוי זכוכית על השקופית. ברגע שהכיסוי החליק, שקופיות יבשות מסומנות על כל נייר שאינו נקבובי במשך שלושה עד חמישה ימים, מזיז אותן מעט, במיוחד לאחר היום הראשון כדי למנוע הידבקות. מאוחר יותר העבר את השקופיות למחזיקי שקופיות ובאופן אידיאלי, שקופיות יבשות במשך שלושה שבועות לפחות לפני בדיקתן.

כדי לנתח את צפיפות עמוד השדרה הדנדריטי בתאי עצב פירמידליים הן של קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית והן של אזור CA1 של ההיפוקמפוס, למדוד את האורך הדנדריטי באמצעות תוכנית ניתוח תמונה. לספור את קוצים על dendrites באמצעות מונה יד ולתעד הן אורך ומספר קוצים. לניתוח, בחרו נוירונים עם גופי תאים ודנדריטים בעודם ספוגים, ודנדריטים רציפים ונבדלים מהתאים הסמוכים.

האיור מראה דוגמאות של תאים ספוגים גולגי באזור CA1 של ההיפוקמפוס מוצג בעוצמה נמוכה וגבוהה. האיור ממחיש ניסוי שבו צפיפות עמוד השדרה הדנדריטית הבסיסית גדלה על תאים פירמידליים בחולדות זכר ונקבה מתבגרים לאחר העשרה סביבתית ב- CA1 ובקליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית. זה מאתגר לשמור על החלקים קרים מספיק בעת חיתוך ואנחנו משתמשים במידה רבה של תרסיס הקפאה כדי לעשות את זה.

ולאחר מכן, קשה לקבל את החלקים על השקופיות ויש להם יבש שטוח. טכניקה זו משמשת לבחינת מאפיינים נוירואנטומיים. זה יכול לשמש לבד או בשילוב עם שיטות מעקב נוירואנטומיות אחרות.