פרוטוקול זה מאפשר גילוי של נמטידים חדשניים כדי להילחם ב-Ditylenchus dipsaci על ידי טכניקת התרבות ומסכים כימיים בעלי תפוקה בינונית. הפשטות של טכניקה זו מאפשרת סינון של אלפי תרכובות בשבוע כדי לזהות תרכובות עם פוטנציאל נמטיסדלי. טכניקה זו יכולה לזהות תרכובות חדשות כדי להרוג נמטודות טפיליות של צמחים של יבולים, ולכן, להגדיל את אספקת המזון העולמית.
כדי להתחיל, להכין 500 מיליליטר של אגר מזין, או NA מדיה, עם 23 גרם לליטר של NA ומים טהורים במיוחד. באמצעות טכניקה סטרילית, יוצקים 25 מיליליטרים של מדיית NA אוטוקלבית לתוך 20 צלחות פטרי חד-פעמיות בקוטר 100 מילימטרים ובעומק 15 מילימטרים. הכן 500 מיליליטרים של Gamborg B5, או GA מדיה, המכיל 3.2 גרם לליטר של מדיום בסיסי GA עם אורגנים מינימליים, 20 גרם לליטר סוכרוז, 15 גרם לליטר של אגר, ומים מזוקקים.
בטכניקה סטרילית, יוצקים 50 מיליליטרים של מדיית GA אוטוקלבית לתוך 10 כלי פטרי חד פעמיים. כדי לבצע עיקור זרעים, יוצקים 150 זרעי אפונה לכוס סטרילית של שני ליטרים עם מוט ערבוב ליד להבת מבער בונזן על ספסל מעבדה. מוסיפים לזרעים 200 מיליליטרים של 95% אתנול ומערבבים במרץ על צלחת הערבוב במשך חמש דקות.
לאחר מכן, שפכו אתנול לתוך מיכל פסולת. יוצקים תמיסת אקונומיקה לתוך הכוס כדי לטבול לחלוטין את הזרעים. מערבבים במרץ על צלחת ערבוב במשך 20 דקות.
לאחר מכן, שפכו את האקונומיקה למיכל פסולת. יוצקים מים מזוקקים לתוך הכוס כדי לטבול את הזרעים ולערבב במרץ על צלחת ערבוב במשך 20 דקות. לאחר שטיפת המים הסופית, יוצקים זרעים מעוקרים לתוך צלחת הפטרי הכוס.
כדי לבדוק אם יש זיהום, העבירו שישה זרעים לכל צלחת NA באורך 10 ס"מ במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית באמצעות מלקחיים מעוקרים. מסדרים את הזרעים סביב היקף הצלחת. עוטפים את הצלחות בנפרד בסרט עטיפה במעבדה ודוגרים אותן בחושך במשך שלושה ימים בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס.
במכסה זרימה למינרי, צלחת שני זרעים לא מזוהמים על כל צלחת GA עם מלקחיים מעוקרים. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 7 עד 10 ימים כדי לאפשר לזרעים לנבוט. להכין 50 מיליליטר של 20 גרם לליטר תמיסת סוכרוז.
המסנן מעקר את תמיסת הסוכרוז ומניח בצד. במכסה גלימה למינרי, חותכים חתיכת אגר המכילה רקמת שורש מצלחת תרבית קיימת. פיפטה 500 מיקרוליטרים של תמיסת סוכרוז על צלחת GA חדשה עם שתילי אפונה ומניחים קוביית אגר על גבי הסוכרוז.
שמרו על התרבות בקופסה מרופדת בנייר אלומיניום בטמפרטורת החדר. כדי לשמור על התרבות, תת-תרבות הנמטודות על צלחות GA טריות כל שמונה עד תשעה שבועות. נמטודות מוכנות לחילוץ לאחר כשמונה שבועות.
במכסה גלימה למינרי, חותכים את רקמת האגר והשורש לקוביות של סנטימטר אחד עם אזמל סטרילי. מעבירים את קוביות האגר לתוך המשפך המרופד במסנן הקפה ושופכים באיטיות מים מזוקקים על האגר כדי להרטיב את מסנן הקפה. מוציאים את המשפך המרופד במסנן הקפה מהכוס וממלאים את הכוס במים מזוקקים עד שמפלס המים פשוט נוגע בתחתית המסנן ברגע שמחליפים את המשפך המרופד במסנן הקפה.
מכסים את המשפך והכוס מרופדים במסנן קפה בנייר אלומיניום. כדי לאסוף את התולעים, הסירו את המשפך המרופד במסנן הקפה ושאפו את 40 מיליליטר המים העליונים מכוס האיסוף, מבלי לשבש את התולעים המיושבות. אספו את הנוזל הנותר לתוך צינור צנטריפוגה חרוטית של 15 מיליליטר עם פיפטה סרולוגית פלסטית של 10 מיליליטר.
כדי להכין את לוחות הבדיקה, יוצקים מים מזוקקים אוטוקלאבים לתוך שוקת סטרילית ומחלקים 40 מיקרוליטרים של מים מזוקקים מהשוקת לכל באר של צלחת שטוחה בעלת 96 בארות עם פיפטה רב-ערוצית. הוסיפו כימיקלים מלוחות המאגר הכימיים בני 96 הבארות ללוחות הבדיקה על ידי הצמדה שלוש פעמים לתוך הלוח הכימי. לאחר מכן, העבר את הפינים 10 פעמים לתוך לוחית הבדיקה.
כתם על נייר מול תמיסת הניקוי. כדי לספור את מספר הנמטודות מהאוסף, ראשית, השהה מחדש את האוסף ולאחר מכן פיפט חמישה מיקרוליטרים של הפתרון באמצעות טיפים בעלי שמירה נמוכה על שקופית. ספרו את מספר הנמטודות בחמישה מיקרוליטרים באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה.
לאחר מכן, התאימו את הריכוז לשתי תולעים לכל מיקרוליטר באמצעות מים סטריליים ומזוקקים. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטרים של הדגימה לכל באר של לוחות 96 הבאר עם פיפטה רב-ערוצית ושוקת. עוטפים את הצלחות במגבת נייר לחה ומניחים אותן בקופסה.
לאחר מכן, הוסיפו מגבת נייר לחה במיוחד כדי לייצב ולהבטיח תנועה מינימלית של הצלחות והדבקה על כרית דביקה באינקובטור רועד של 20 מעלות צלזיוס שנקבע ל-200 סל"ד. צפו בלוחות ביום החמישי תחת מיקרוסקופ מנתח. ספרו את מספר ה-D.dipsaci הנייד והסך הכל בבקרות ממסים של DMSO ובבארות שטופלו בתרופות.
אם התולעים חסרות תנועה, הוסיפו שני מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסיד טוחן אחד לריכוז סופי של 40 מילימולרים לבאר כדי לעורר את התנועה. חשב את שיעור התולעים הניידות. במסכי D.dipsaci, בארות שהניבו באופן משוחזר 0% תולעים ניידות מסווגות כלהיטים חזקים.
שלוש צלחות תרופות שונות נבדקו בריכוז של 60 מיקרומולר, כאשר לכל צלחת תרופה יש שלושה שכפולים ביולוגיים. כל שלוש הצלחות כללו 6% מהפקדים של DMSO-ממסים בלבד. צלחות רבות שהכילו תרופות מספריית המולקולות הקטנות חסרו כל מולקולה עם פעילות ביולוגית נצפית נגד D.dipsaci.
לחלק מהלוחות היו להיטים הניתנים לשחזור מלא, בעוד שאחרים שהכילו נמטידים מאופיינים היו מגוונים בפעילותם. סרגלי השגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע. כאן, פלואופירם הפגין פעילות חזקה במבחן.
פלואופירם גרם להשפעה תלוית מינון לכאורה על ניידות D.dipsaci עם EC50 של 9.3 מיקרומולר. לאוקסמיל לא הייתה השפעה משמעותית על הניידות עד לריכוז של 120 מיקרומולרים. לאוקסמיל לא הייתה השפעה משמעותית על הניידות עד לריכוז של 120 מיקרומולר.
התוספת של נתרן הידרוקסיד שיפרה את רגישות הבדיקה באיתור תולעים חסרות תנועה. 40-millimolar של נתרן הידרוקסיד שימש כנקודת הקצה של הבדיקה כדי לעורר תנועה אצל אנשים בעלי יכולת, ובכך להבחין בין תולעים נחות לתולעים חולות. פרוטוקול זה איפשר זיהוי של תרכובות עם מנגנוני פעולה חדשניים נגד D.dipsaci ומינים אחרים.
