이 프로토콜은 기술과 중간 처리량의 화학 스크린을 배양하여 Ditylenchus dipsaci와 싸우기위한 새로운 nematicides의 발견을 허용합니다. 이 기술의 단순성으로 인해 일주일에 수천 개의 화합물을 스크리닝하여 nematicidal 잠재력을 가진 화합물을 식별 할 수 있습니다. 이 기술은 작물의 식물 기생 선충류를 죽이는 새로운 화합물을 식별 할 수 있으므로 세계 식량 공급을 증가시킬 수 있습니다.
시작하려면 500 밀리리터의 영양 한천 또는 NA 배지를 NA 리터 당 23 그램과 초순수로 준비하십시오. 멸균 기술을 사용하여 25 밀리리터의 오토클레이브 NA 매체를 일회용 100mm 직경, 15mm 깊이의 페트리 접시 20 개에 붓습니다. 최소 유기물을 함유 한 GA 기본 배지 리터 당 3.2 그램, 수크로오스 리터 당 20 그램, 한천 리터 당 15 그램 및 증류수가 들어있는 Gamborg B5 또는 GA 배지 500 밀리리터를 준비하십시오.
멸균 기술을 사용하여 오토클레이브 GA 미디어 50 밀리리터를 일회용 페트리 접시 10 개에 붓습니다. 종자 살균을 수행하려면 실험실 벤치의 Bunsen 버너 불꽃 근처의 교반 막대가있는 멸균 된 두 리터 비커에 완두콩 씨앗 150 개를 붓습니다. 씨앗에 95 % 에탄올 200 밀리리터를 넣고 볶음 접시에서 5 분 동안 격렬하게 저어줍니다.
그런 다음 에탄올을 폐기물 용기에 붓습니다. 표백제 용액을 비커에 부어 씨앗을 완전히 담그십시오. 볶음 접시에 20 분 동안 격렬하게 저어줍니다.
그런 다음 표백제를 폐기물 용기에 붓습니다. 비커에 증류수를 붓고 씨앗을 담그고 볶음판에 20분 동안 격렬하게 저어줍니다. 마지막 물 세척 후, 유리 페트리 접시에 살균 된 씨앗을 붓는다.
오염을 확인하려면 멸균된 포셉을 사용하여 층류 후드의 각 10센티미터 NA 플레이트에 여섯 개의 씨앗을 옮깁니다. 접시의 둘레 주위에 씨앗을 배열하십시오. 플레이트를 실험실 포장 필름에 개별적으로 감싸고 섭씨 26도에서 사흘 동안 어둠 속에서 배양하십시오.
층류 후드에서 멸균된 포셉으로 각 GA 플레이트에 오염되지 않은 두 개의 씨앗을 플레이트에 플레이트합니다. 씨앗이 싹을 틔울 수 있도록 실온에서 7 ~ 10 일 동안 배양하십시오. 리터 당 20 그램의 수크로오스 용액 50 밀리리터를 준비하십시오.
필터는 자당 용액을 멸균하고 따로 보관하십시오. 층류 후드에서 뿌리 조직을 포함하는 한천 조각을 기존 배양 플레이트에서 자릅니다. 완두콩 묘목이있는 새로운 GA 플레이트에 500 마이크로 리터의 자당 용액을 피펫하고 자당 위에 한천 큐브를 놓습니다.
실온에서 알루미늄 호일이 늘어선 상자에 배양물을 유지한다. 문화를 유지하기 위해, 선충류를 여덟 주에서 아홉 주마다 신선한 GA 플레이트에 계대배양한다. 선충류는 약 여덟 주 후에 추출 될 준비가되었습니다.
층류 후드에서 한천과 뿌리 조직을 멸균 메스가있는 한 센티미터 큐브로 자릅니다. 한천 큐브를 커피 필터가 늘어선 깔때기로 옮기고 한천에 증류수를 천천히 부어 커피 필터를 적셔줍니다. 비이커에서 커피 필터가 늘어선 깔때기를 제거하고 커피 필터가 늘어선 깔때기를 교체하면 수위가 필터 바닥에 닿을 때까지 비이커를 증류수로 채 웁니다.
커피 필터가 늘어선 깔때기와 비커를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 웜을 수집하려면 커피 필터가 늘어선 깔때기를 제거하고 수집 비이커에서 상위 40 밀리리터의 물을 흡인하여 정착 된 웜을 방해하지 마십시오. 나머지 액체를 10 밀리리터 플라스틱 혈청 학적 피펫이있는 15 밀리리터 원뿔형 원심 분리 튜브에 모으십시오.
분석 플레이트를 준비하려면 오토클레이브 증류수를 멸균 트로프에 붓고 골짜기에서 증류수 40 마이크로리터를 다채널 피펫이 있는 평평한 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 화학 플레이트에 세 번 고정하여 96웰 화학 스톡 플레이트의 화학 물질을 분석 플레이트에 추가합니다. 이어서, 핀을 분석 플레이트 내로 10회 옮긴다.
세척 용액 앞의 종이에 닦으십시오. 컬렉션에서 선충류의 수를 계산하려면 먼저 컬렉션을 다시 일시 중단 한 다음 슬라이드에 낮은 보존 팁을 사용하여 용액의 다섯 마이크로 리터를 피펫하십시오. 해부 현미경을 사용하여 다섯 마이크로 리터의 선충류의 수를 계산하십시오.
그런 다음 멸균 증류수를 사용하여 마이크로 리터 당 두 개의 웜으로 농도를 조정하십시오. 다음으로, 10 마이크로리터의 샘플을 다채널 피펫 및 골짜기로 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 접시를 젖은 종이 타월로 싸서 상자에 넣으십시오.
그런 다음 여분의 젖은 종이 타월을 추가하여 플레이트의 움직임을 최소화하고 200RPM으로 설정된 섭씨 20도 진탕 인큐베이터의 끈적 끈적한 패드에 부착하십시오. 해부 현미경으로 다섯 번째 날에 플레이트를 관찰하십시오. DMSO 용매 대조군 및 약물 처리 웰에서 이동 및 총 D.dipsaci의 수를 계산합니다.
웜이 움직이지 않으면 운동을 자극하기 위해 웰에 40 밀리몰의 최종 농도에 두 마이크로 리터의 원몰 수산화 나트륨을 첨가하십시오. 모바일 웜의 비율을 계산합니다. D.dipsaci 화면에서는 재현 가능하게 0 % 모바일 웜을 산출 한 우물이 강력한 히트로 분류됩니다.
세 개의 상이한 약물 플레이트를 60-마이크로몰의 농도로 스크리닝하였고, 여기서 각각의 약물 플레이트는 세 개의 생물학적 반복실험을 갖는다. 세 플레이트 모두 DMSO 용매 전용 대조군의 6%를 포함했다. 소분자 라이브러리의 약물을 포함하는 많은 플레이트에는 D.dipsaci에 대해 관찰 가능한 생체 활성을 가진 분자가 부족했습니다.
일부 판은 완전히 재현 가능한 히트를 보였고, 다른 판에는 특징적인 네마티드가 포함되어 있으며 그 활성이 다양했습니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 여기서, fluopyram은 분석에서 강력한 활성을 나타내었다.
Fyopyram은 9.3-마이크로몰의 EC50을 사용하여 D.dipsaci 이동성에 대한 명백한 용량 의존적 효과를 유도하였다. 옥사밀은 120-마이크로몰 농도까지 이동성에 유의한 영향을 미치지 않았다. 옥사밀은 120-마이크로몰의 농도까지 이동성에 유의한 영향을 미치지 않았다.
수산화나트륨의 첨가는 움직이지 않는 벌레를 검출하는데 있어서 분석 민감도를 향상시켰다. 40 밀리몰의 수산화나트륨은 유능한 개체에서 움직임을 자극하기 위해 분석 종점으로 사용되었고, 따라서 휴식 웜과 병든 웜을 구별합니다. 이 프로토콜은 D.dipsaci 및 다른 종에 대한 새로운 작용 메커니즘을 가진 화합물의 식별을 가능하게했습니다.
