Este protocolo permite a descoberta de novos nematicides para combater o dipsaci ditylenchus através da técnica de cultivo e telas químicas de médio rendimento. A simplicidade dessa técnica permite a triagem de milhares de compostos por semana para identificar compostos com potencial nematicida. Esta técnica pode identificar novos compostos para matar nematoides parasiticos vegetais das culturas e, portanto, aumentar a oferta global de alimentos.
Para começar, prepare 500 mililitros de ágar nutriente, ou mídia NA, com 23 gramas por litro de NA e água ultra-pura. Usando técnica estéril, despeje 25 mililitros de mídia NA autoclaved em 20 placas descartáveis de 100 milímetros de diâmetro e 15 milímetros de profundidade de Petri. Prepare 500 mililitros de Gamborg B5, ou mídia GA, contendo 3,2 gramas por litro de meio basal GA com orgânicos mínimos, 20 gramas por litro de sacarose, 15 gramas por litro de ágar e água destilada.
Usando técnica estéril, despeje 50 mililitros de mídia GA autoclaved em 10 placas de Petri descartáveis. Para realizar a esterilização de sementes, despeje 150 sementes de ervilha em um béquer estéril de dois litros com uma barra de agitação perto de uma chama de queimador bunsen em um banco de laboratório. Adicione 200 mililitros de 95% de etanol às sementes e mexa vigorosamente na placa de mexida por cinco minutos.
Em seguida, despeje o etanol em um recipiente de lixo. Despeje a solução de alvejante no béquer para imergir completamente as sementes. Mexa vigorosamente em uma placa de mexida por 20 minutos.
Em seguida, despeje o alvejante em um recipiente de lixo. Despeje água destilada no béquer para mergulhar as sementes e mexa vigorosamente em um prato de mexida por 20 minutos. Após a lavagem final da água, despeje sementes esterilizadas na placa de vidro Petri.
Para verificar se há contaminação, transfira seis sementes para cada placa NA de 10 centímetros no capô de fluxo laminar usando fórceps esterilizados. Disponha as sementes ao redor da circunferência do prato. Enrole as placas individualmente em filme de embalagem de laboratório e incuba-as no escuro por três dias a 26 graus Celsius.
Em uma capa de fluxo laminar, placa duas sementes não contaminadas em cada placa de GA com fórceps esterilizados. Incubar em temperatura ambiente por 7 a 10 dias para permitir que as sementes brotem. Prepare 50 mililitros de solução de sacarose de 20 gramas por litro.
O filtro esteriliza a solução de sacarose e reserve. Em um capô de fluxo laminar, corte um pedaço de ágar contendo tecido radicular de uma placa de cultura existente. Pipeta 500 microliters de solução de sacarose em nova placa GA com mudas de ervilha e coloque um cubo de ágar em cima da sacarose.
Mantenha a cultura em uma caixa forrada com papel alumínio à temperatura ambiente. Para manter a cultura, subcultura os nematoides em placas de GA frescas a cada oito a nove semanas. Nematoides estão prontos para serem extraídos após cerca de oito semanas.
Em uma capa de fluxo laminar, corte o ágar e o tecido radicular em cubos de um centímetro com um bisturi estéril. Transfira os cubos de ágar para o funil revestido de filtro de café e despeje lentamente água destilada no ágar para umedecer o filtro de café. Remova o funil forrado de filtro de café do béquer e encha o béquer com água destilada até que o nível da água esteja apenas tocando o fundo do filtro assim que o funil forrado pelo filtro de café for substituído.
Cubra o funil forrado de filtro de café e o béquer com papel alumínio. Para coletar os vermes, remova o funil forrado de filtro de café e aspire os 40 mililitros de água do béquer de coleta, não interrompendo os vermes assentados. Colete o líquido restante em um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros com uma pipeta sorológica de plástico de 10 mililitros.
Para preparar as placas de ensaio, despeje água autoclave destilada em um cocho estéril e dispense 40 microliters de água destilada do cocho em cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços com uma pipeta multicanal. Adicione produtos químicos das placas químicas de 96 poços às placas de ensaio, fixando três vezes na placa química. Em seguida, transfira os pinos 10 vezes para a placa de ensaio.
Borrida no papel em frente à solução de limpeza. Para contar o número de nematoides da coleção, primeiro, suspenda novamente a coleção e, em seguida, pipeta cinco microliters da solução usando pontas de baixa retenção em um slide. Conte o número de nematoides em cinco microlitros usando um microscópio de dissecção.
Em seguida, ajuste a concentração para dois vermes por microliter usando água estéril e destilada. Em seguida, adicione 10 microliters da amostra a cada poço das placas de 96 poços com uma pipeta multicanal e um cocho. Enrole as placas com uma toalha de papel úmida e coloque-as em uma caixa.
Em seguida, adicione uma toalha de papel úmido extra para estabilizar e garantir o movimento mínimo das placas e afixar em uma almofada pegajosa em uma incubadora de agitação de 20 graus Celsius definida para 200 RPM. Observe as placas no quinto dia sob um microscópio dissecando. Conte o número de d.dipsaci móvel e total em controles de solventes DMSO e poços tratados com drogas.
Se os vermes estiverem imóveis, adicione dois microlitradores de hidróxido de sódio de um molar a uma concentração final de 40 milimôlares ao poço para estimular o movimento. Calcule a proporção de vermes móveis. Nas telas D.dipsaci, poços que reproduzivelmente renderam vermes 0% móveis são categorizados como hits fortes.
Três placas de drogas diferentes foram rastreadas em uma concentração de 60 micromolar, onde cada placa de droga tem três réplicas biológicas. Todas as três placas incluíam 6% dos controles somente de solventes DMSO. Muitas placas contendo drogas da pequena biblioteca de moléculas não tinham qualquer molécula com bioatividade observável contra d.dipsaci.
Algumas placas tinham golpes totalmente reprodutíveis, enquanto outras contendo nematicides caracterizados variavam em sua atividade. As barras de erro representam o erro padrão da média. Aqui, o fluopyram exibiu atividade robusta no ensaio.
Fluopyram induziu um efeito aparente dependente de dose na mobilidade d.dipsaci com um EC50 de 9,3-micromolar. O oxamílico não teve efeito significativo na mobilidade até uma concentração de 120 micromolares. O oxamílico não teve efeito significativo na mobilidade até uma concentração de 120 micromolar.
A adição de hidróxido de sódio melhorou a sensibilidade do ensaio na detecção de vermes imóveis. 40 milimiliar de hidróxido de sódio foi usado como ponto final de ensaio para estimular o movimento em indivíduos capazes e, assim, distinguir vermes descansando de vermes doentes. Este protocolo permitiu a identificação de compostos com novos mecanismos de ação contra d.dipsaci e outras espécies.
