פרוטוקול זה מספק דרך חדשה לחקור את פתיחת ההולכות הנמוכה של נקבובית המעבר החדירות המיטוכונדרית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת דרך קלה למדוד את ההסתברות הפתוחה של הנקבובית כפונקציה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדרית. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת בקלות על מיטוכונדריה מבודדת מכל מערכת איברים ומינים.
התחילו בכיול אלקטרודת החמצן על ידי הנחת טיפה של 50% תמיסת אלקטרוליט אשלגן כלוריד על גבי כיפת דיסקת האלקטרודה. מניחים חתיכה קטנה של ספייסר נייר סיגריות בגודל שני סנטימטרים רבועים המכוסה בחתיכה מעט גדולה יותר של קרום הפוליטטרפלואורואתילן מעל טיפת האלקטרוליטים. לאחר מכן השתמש בכלי המוליך כדי לדחוף את טבעת ה-O של דיסק האלקטרודה הקטן מעל כיפת האלקטרודה.
לאחר מכן, מלאו את באר המאגר עם תמיסת האלקטרוליטים. הניחו את טבעת ה-O הגדולה יותר בהפסקה סביב דיסק האלקטרודה היטב. לאחר מכן התקן את הדיסק לתוך תא האלקטרודה, וחבר אותו ליחידת הבקרה.
הוסיפו לתא התגובה שני מיליליטרים של מים שעברו דה-יוניזציה רוויית אוויר, ואת המגנט המצופה בפוליטטרפלואורואתילן. בסיום, חבר את התא לחלק האחורי של יחידת הבקרה. הגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס, ואת מהירות הערבוב ל-100.
אפשרו לטמפרטורת המערכת להתאזן במשך 10 דקות לפני הכיול. לאחר הבטחת הטמפרטורה, מהירות הערבוב והלחץ הנכונים, תחת הכרטיסייה כיול, בחר באפשרות כיול פאזה נוזלית לביצוע כיול פאזה נוזלית. לאחר מכן לחץ על אישור, והמתן עד שהאות יתיישר.
ברגע שמגיעים למישור, לחץ על אישור. לאחר מכן להוסיף כ 20 מיליגרם של נתרן dithionite כדי לקבוע אפס חמצן בתא. שוב, לחץ על אישור, והמתן עד שהאות יתיישר לפני שתלחץ על שמור כפתור כדי לקבל את הכיול. כדי להכין את הטטרפנילפוספוניום, או מכלול האלקטרודה הסלקטיבית TPP, מלאו את קצה האלקטרודה הסלקטיבית TPP בתמיסת TPP של 10 מילימולאר באמצעות מזרק ומחט גמישה.
הימנעו מבועות אוויר בעת מילוי קצה האלקטרודה. שחררו את מכסה מחזיק האלקטרודה כדי להכניס את אלקטרודת הייחוס הפנימית לקצה ה-TPP. בסיום, הרכיבו את מנגנון האלקטרודה הסלקטיבית TPP, כולל אלקטרודת הייחוס ומחזיק האלקטרודה.
הדקו את המכסה כדי לאבטח את הקצה. לאחר מכן חבר את הכבל ליציאת העזר של תיבת הבקרה, ולמחזיק האלקטרודה TPP. הכנס את האלקטרודות הסלקטיביות והייחוס TPP למכלול הבוכנה המותאם לאלקטרודות סלקטיביות יונים.
חבר את אלקטרודת הייחוס ליציאת הייחוס של תיבת הבקרה. לאחר מכן, כדי להכין את תא התגובה, להוסיף מיליליטר אחד של תערובת התגובה לתא התגובה מבלי ליצור בועות אוויר. סגור את התא באמצעות מכלול הבוכנה המותאם עם אלקטרודות TPP-סלקטיביות וייחוס במקומן.
לאחר סגירת התא, הכניסו ריאגנטים נוספים ישירות לתא התגובה באמצעות מיקרו-מזרקים נפרדים ששונו באמצעות צינורות פלסטיק. כאשר ההתקנה מוכנה, בחר עבור כדי להתחיל להקליט. לאחר קבלת אות מתח יציב, כייל את האלקטרודה הסלקטיבית TPP על ידי הוספת דרגות מיקרומולריות אחת של תמיסת TPP 0.1 מילימולרית כדי להשיג ריכוז סופי של שלושה מיקרומולרים.
שימו לב לירידה הלוגריתמית באות המתח TPP עם כל תוספת. לאחר ייצוב עקבות חמצן ו-TPP, הוסיפו 100 מיקרוגרם של מיטוכונדריה קרדיומיוציטים שהוכנו זה עתה לתא התגובה באמצעות יציאת תוספת המגיבים במכלול הבוכנה לריכוז סופי של 0.1 מיליגרם למיליליטר. שימו לב לירידה ברמות החמצן בתא כאשר המיטוכונדריה הופכת להיות אנרגטית וצורכת חמצן.
כמו כן, ראה את העלייה הפתאומית באות המתח TPP כאשר המיטוכונדריה מייצרת פוטנציאל ממברנה ולוקחת TPP מהתמיסה. לאחר מכן הוסף 2.5 מיקרוגרם לכל מיליליטר אוליגומיצין כדי לגרום לנשימה של מצב 4. כדי להעריך את ההסתברות הפתוחה של נקבוביית מעבר החדירות המיטוכונדרית, או mPTP, שימו לב לירידה בפוטנציאל הממברנה לאורך זמן במהלך נשימת הדליפה.
לאחר מימוש פוטנציאל הממברנה הרצוי, הוסף ציקלוספורין מיקרומולרי אחד A כמעכב mPTP לתא התגובה כדי להעריך את ההסתברות הפתוחה של ה- mPTP באותו פוטנציאל ממברנה ספציפי. לאחר מכן מדוד את ההשפעה של ציקלוספורין A על צריכת החמצן ופוטנציאל הממברנה לפני ואחרי תוספת ציקלוספורין A. בעקומות הייצוגיות של צריכת חמצן בו-זמנית ופוטנציאל הממברנה, פוטנציאל הממברנה הגבוה נקבע על אפס, בינוני בחמישה ונמוך ב-10 מיליוולטים ביחס לרמת הכיול של שני המיקרומולרים TPP.
המיטוכונדריה באפס מיליבולטים הציגה הסתברות סגורה של 100% mPTP, וב-10 מיליוולטים הפגינה הסתברות פתוחה של 100%. לאחר תוספת אוליגומיצין, לא נצפה הבדל משמעותי בצריכת החמצן, מה שמרמז על כך שאדנוזין טריפוספט, או ATP סינתאז, תורם באופן מינימלי לנשימה של המדינה 2. יתר על כן, הושוו קצב צריכת החמצן ופוטנציאל הממברנה לפני ואחרי תוספת ציקלוספורין A.
ירידה בקצב צריכת החמצן ועלייה בייצוב פוטנציאל הממברנה הצביעו על סגירת mPTP פתוח. כאשר ה-mPTP נסגר, לא נרשמה ירידה בקצב צריכת החמצן, ופוטנציאל הממברנה המשיך לרדת. התוצאות הדגימו הסתברויות mPTP סגורות ופתוחות דומות בפוטנציאלי ממברנה גבוהים ונמוכים בבקרת FVB ובמיטוכונדריה לבבית נוקאאוט Fmr1.
בפוטנציאל הממברנה הבינונית, מיטוכונדריה לבבית נוקאאוט Fmr1 הדגימה הסתברות mPTP סגורה מוגברת בהשוואה לבקרות FVB. אין להכניס בועות אוויר לחדר, שכן הדבר יוביל לקריאות צריכת חמצן לא יציבות, ויקשה על הפרשנות. לאחר הליך זה, ניתן למדוד את יכולת העמסת הסידן.
שיטה זו מעריכה את פתיחת המוליכות הגבוהה של הנקבובית, ומשלימה את תוצאות הטכניקה שלנו.
