עבודה זו נתמכה על ידי RO1-AG028614 לג&#39;, RO1-AR063084to NLW, וRO1-AR057404 לJZ.

1. הגדרת מערכת זלוף אוסמוטי מתח איור 1 הוא פרוטוקול סכמטי של סידן ניצוצות הערכה בסיבי שריר שלד בשלמותה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את micromanipulator שלושה צירים (XYZ) מסוגל מיקום קצה היציאה של מערכת זלוף המכילה מינימום של שני ערוצים. זה יכול להיעשות עם חבית Luer-מזרק חד פעמית עם שלוש מצורפים - הדרך Luer - ברזלים לוק לעבור על ו / או לבטל את הזרימה של פתרונות זלוף. ערוצי זלוף אלה צריכים להיות מסוגלים לספק&gt; 1 מיליליטר / דקה של פתרון באמצעות קצה זלוף יחיד עם&gt; 0.2 בקוטר מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען שני ערוצים של מערכת זלוף, אחד עם איזוטוניים Tyrode פתרון והשני עם hypotonic Tyrode פתרון. </li></ol> 2. סיבי שריר פגוע הכנה יחידה המכופפת digitorum רוויס (FDB) מעכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרגל מאיחוד אירופי בעכברthanized הבא הנחיות NIH וIACUC באמצעות זוג מספריים לנתח כבד על ידי חיתוך דרך הרגל מעל למפרק הקרסול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את הרגל על חדר נתיחה מלא מינימאלי Ca 2 + Tyrode פתרון עם משטח plantar פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח FDB ידי חיתוך הגיד ומשייכתו בעדינות על הגיד להפריד את השרירים מהרקמה הסובבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את הנתיחה על ידי חיתוך הגיד הדיסטלי שבו סניפים לספרות בודדת בשכבות עמוקות של השרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את שריר FDB ידי להרים עם מלקחיים באמצעות הגידים שלה כדי למנוע נזק נוסף לסיבי שריר ואת המקום לתוך צינור עם aliquot מופשר של Collagenase עיכול פתרון prewarmed 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצינור המכיל FDB זקוף על שייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס במשך דקות 60-90 עם מהירות של 160 סל&quot;ד. פרוטוקול דיסוציאציה חבילות שריר זה יש לבחון באופן ניסיוני לזנים שונים של בעלי חיים, במיוחד עבור אלה מחלה / סיבי מוטציה פגיעים לנזק בממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את FDB מתעכל לתוך צינור עם 700 μl של איזוטוניים Tyrode פתרון ועדינות triturate כדי לשחרר את הסיבים על ידי ציור של השריר מספר פעמים באמצעות סדרה של 200 טיפים מ&quot;ל micropipette של ירידה בקוטר בהדרגה באמצעות חיתוך בסכין גילוח נקי כדי להסיר את הטיפים 200 micropipette מיליליטר. כדי להימנע מסיבי נזק בשרירים חלשים במיוחד ממחלה, לוודא את הקצה הוא פשוט גדול מספיק כדי לאפשר צרור הסיבים לעבור דרך ללא דבק. אל תכריח את החבילה דרך קטנה מדי פתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט את סיבי FDB בעדינות על ידי ההקשה וresuspending סיבי FDB בצינור ולאחר מכן ציור מתוך 70 מיליליטר (1/10 של סיבי סך הכל) עם micropipette מיליליטר לחתוך 200 למרכז צלחת 35 מ&quot;מ דלתא TPG מכילה 1 מיליליטר של איזוטוניים Tyrode פתרון כדי להפחית דיפוזיה על פני הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר הסיבים בודדים ללא פגע בדish באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה. הוספת aliquots נוספים של סיבי FDB להשיג 3-4 סיבים שלמים בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את סיבי שריר מבודדים נוספים על 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש תוך 6 שעות. </li></ol> 3. טוען Fluo-4:00 דיי וCa 2 + הדמיה (ניצוצות מדידה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 500 מיליליטר של איזוטוניים Tyrode פתרון מצלחת עם סיבי FDB מצופים לתוך צינור עם מיליליטר 10 מניית AM Fluo-4 (1 מ&quot;מ), לערבב ולהוסיף חזרה לצלחת לריכוז AM Fluo-4 סופי של 10 מ&quot;מ. לחלופין, חומצת pluronic ניתן להשתמש בם כדי להגביר את יעילות טעינת צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען ל60 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הסיבים על ידי ציור בזהירות 500 מיליליטר של Fluo-4 המכיל AM איזוטוניים Tyrode פתרון מהצלחת עם קצה micropipette נימול 200 מיליליטר פלסטיק ולהחליף עם נפח שווה של טרי איזוטוניים Tyrode פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה 3 פעמים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את התפקוד המיטוכונדריה, להעביר 500 מיליליטר של IsotoNIC Tyrode פתרון מצלחת עם סיבי FDB לתוך צינור עם 5 מיליליטר מניית TMRE (1 מ&quot;מ), לערבב, ולהוסיף חזרה לצלחת לריכוז סופי של 50 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הסיבים על ידי הציור בזהירות 500 מיליליטר של איזוטוניים Tyrode פתרון מהצלחת עם קצה חתוך 200 מיליליטר פלסטיק micropipette ולהחליף עם נפח שווה של טרי איזוטוניים Tyrode פתרון המכיל TMRE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה 3 פעמים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את המנה למיקרוסקופ confocal ובחר סיבים שלמים עם פסים בהירים וקרום sarcolemmal חלק לניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את קצה מיקרומטר 400-500 מערכת זלוף מסיבי שריר היעד ומחוץ למרכז באמצעות פקדי micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הזרימה איזוטוניים Tyrode הפתרון כדי להבטיח את סיבי FDB נשאר במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את אות הקרינה מFluo-4 בבוקר, עם מטרת טבילת שמן 40X ולרגש Fluo-4 בבוקר, עםאותות לייזר ארגון (ננומטר 488 גל עירור) ופליטת שיא (אורך גל 510-580 ננומטר). עוצמת אות הניאון היא פרופורציונלית לרמה היחסית של ריכוז + Ca 2 תאיים ([Ca 2 +] i). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום Ca 2 + ארעיים על ידי שינוי הלחץ האוסמוטי של הפתרון תאי על מנת לייצר לחץ האוסמוטי בסיבים. בתחילה תנקב סיבים עם פתרון איזוטוניים Tyrode (290 mOsM) (אוסף בסיס ל60 שניות) ולאחר מכן עם פתרון hypotonic Tyrode (170 mOsM) ל100 שניות כדי לגרום לנפיחות. Perfuse סיבי FDB חזרה עם פתרון איזוטוניים Tyrode. באופן כללי, רק אחד הלם אוסמוטי מוחל על סיב בודד בשלמות בצלחת TPG דלתא אחד ואירועי הניצוץ אחרון 10 דקות עבור רכישת נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוקליזציה המרחבית שיא של Ca 2 + ניצוצות (איור 2), תוך שימוש בזמן סדרה של XY תמונות דו ממדיות עם מהירות סריקה של 166 LPS (קו לשנייה, וeaשורת ch המורכבת מ512 פיקסלים וכתוצאה מכך 3.08 שניות / מסגרת) עבור כל תנאי של דקות (1 איזוטוני), מתח hypotonic (100 שניות) ודחק פוסט hypotonic (5 דקות). אותות חנות לניתוח במצב לא מקוון כדי להעריך את התפוצה ואת התדירות של Ca 2 + ניצוצות לאחר השלמת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את סיבים חדשים על מאכל חדש ובצע את אותו פרוטוקול הלם אוסמוטי כדי לגרום Ca 2 + ארעיים. השתמש בקו סריקה confocal מצב (XT) (512 פיקסלים באורך, קצב דגימה של סריקת msec / קו 2 להקליט Ca 2 + ארעיים למשך דקה אחת (כלומר 30,000 שורות) עם קו סריקת confocal ממוקם ישירות מתחת קרום sarcolemmal (איור 3 ). שנה את קו הסריקה למטוסי מוקד שונים לשלוש סדרות רציפים (במרווחי 1-min) של linescans לניתוח של הגודל וקינטיקה של Ca 2 + ניצוצות בודדים להקליט. </li></ol> 4. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף מספר רב שלקו סריקת XT עקבות להעריך את המורפולוגיה וקינטיקה של פרמטרים 2 + ניצוצות Ca נפרדים, כלומר את המשרעת (F / 0 F; בי F 0 הוא 2 + הקרינה Ca המנוחה), זמן עלייה, זמן השיא, המשך (FDHM , משך מלא במחצית גודל), ורוחב מרחבית (FWHM, רוחב מלא במחצית גודל) של הניצוצות שנרשמו. פרמטרים אלה מייצגים את המאפיינים הבסיסיים של gating RYR Ca 2 + ערוצים כגון Ca 2 + השטף (אמפליטודה), וקינטיקה gating של RYRs (משך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את נתוני תמונה דיגיטליים עם אלגוריתם שפותח במיוחד עבור, חצי אוטומטי שנוצר עם שפת עיבוד התמונה IDL (נתונים אינטראקטיביים שפה), כפי שתואר לעיל 11,16. בגלל קינטיקה הייחודית של Ca 2 + שחרור במקרה של 2 ניצוצות + Ca המושרה בסיבי FDB ידי מתח האוסמוטי, עדיף לשלב את התכונות ידניות ואוטומטיות של Ca 2 + להצית אירועיםזיהוי ועיבוד עם תוכניות ניתוח תמונה אישית לבנות האלה 11. אלגוריתם זה הוא מאוד שימושי כאשר זה הכרחי כדי לזהות באופן ידני את ההחזר על ההשקעה (אזור של עניין) בחלק מדגמי מחלת שריר. ברגע שהחזר על השקעה מוגדרת, האלגוריתם יכול באופן אוטומטי לגזור את הפרמטרים הניצוץ שהוזכרו לעיל אשר לאחר מכן ניתן לייצא לקובץ Excel. לחלופין, התוכנה הציבורית זמינה עיבוד תמונה, למשל SparkMaster בImageJ, ניתן להשתמש בם כדי להגדיר את מאפייני הקינטית של Ca 2 + ניצוצות והפריסה המרחבית שלהם בשרירי שלד 17. </li></ol>

<ol>
	<li>Stutzmann, G. E., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+Ca2++handling+in+excitable+cells+in+health+and+disease.">Endoplasmic reticulum Ca2+ handling in excitable cells in health and disease.</a> Pharmacol. Rev. 63 (3), 700-727 (2011).</li><li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks.">Calcium sparks.</a> Physiol. Rev. 88 (4), 1491-1545 (2008).</li><li>Brochet, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+release+events+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+the+heart.">Elementary calcium release events from the sarcoplasmic reticulum in the heart.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 740, 499-509 (2012).</li><li>Brochet, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quarky+calcium+release+in+the+heart.">Quarky calcium release in the heart.</a> Circ. Res. 108 (2), 210-218 (2011).</li><li>Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+sparks+in+cardiac+myocytes.">Imaging calcium sparks in cardiac myocytes.</a> Methods Mol. Biol. 689, 205-214 (2011).</li><li>Dulhunty, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation-contraction+coupling+from+the+1950s+into+the+new+millennium.">Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33 (9), 763-772 (2006).</li><li>Dulhunty, A. F., Casarotto, M. G., Beard, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ryanodine+receptor:+a+pivotal+Ca2++regulatory+protein+and+potential+therapeutic+drug+target.">The ryanodine receptor: a pivotal Ca2+ regulatory protein and potential therapeutic drug target.</a> Curr. Drug Targets. 12 (5), 709-723 (2011).</li><li>Kirsch, W. G., Uttenweiler, D., Fink, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spark-+and+ember-like+elementary+Ca2++release+events+in+skinned+fibres+of+adult+mammalian+skeletal+muscle.">Spark- and ember-like elementary Ca2+ release events in skinned fibres of adult mammalian skeletal muscle.</a> J. Physiol. 537, 379-389 (2001).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+probable+role+of+dihydropyridine+receptors+in+repression+of+Ca2++sparks+demonstrated+in+cultured+mammalian+muscle.">A probable role of dihydropyridine receptors in repression of Ca2+ sparks demonstrated in cultured mammalian muscle.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 290 (2), 539-553 (2006).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++sparks+and+embers+of+mammalian+muscle.">Ca2+ sparks and embers of mammalian muscle.</a> Properties of the sources. J. Gen. Physiol. 122 (1), 95-114 (2003).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncontrolled+calcium+sparks+act+as+a+dystrophic+signal+for+mammalian+skeletal+muscle.">Uncontrolled calcium sparks act as a dystrophic signal for mammalian skeletal muscle.</a> Nat. Cell. Biol. 7 (5), 525-530 (2005).</li><li>Teichmann, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+control+over+Ca2++sparks+via+mechanosensitive+channels+is+disrupted+in+dystrophin+deficient+muscle+but+restored+by+mini-dystrophin+expression.">Inhibitory control over Ca2+ sparks via mechanosensitive channels is disrupted in dystrophin deficient muscle but restored by mini-dystrophin expression.</a> PLoS One. 3 (11), e3644 (2008).</li><li>Shkryl, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+amplification+of+ROS+and+Ca2++signals+in+stressed+mdx+dystrophic+skeletal+muscle+fibers.">Reciprocal amplification of ROS and Ca2+ signals in stressed mdx dystrophic skeletal muscle fibers.</a> Pflugers. Arch. 458 (5), 915-928 (2009).</li><li>Lovering, R. M., Michaelson, L., Ward, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malformed+mdx+myofibers+have+normal+cytoskeletal+architecture+yet+altered+EC+coupling+and+stress-induced+Ca2++signaling.">Malformed mdx myofibers have normal cytoskeletal architecture yet altered EC coupling and stress-induced Ca2+ signaling.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 297 (3), 571-580 (2009).</li><li>Weisleder, N., Ma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++sparks+as+a+plastic+signal+for+skeletal+muscle+health,+aging,+and+dystrophy.">Ca2+ sparks as a plastic signal for skeletal muscle health, aging, and dystrophy.</a> Acta. 27 (7), 791-798 (2006).</li><li>Weisleder, N., Zhou, J., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+calcium+sparks+in+intact+and+permeabilized+skeletal+muscle+fibers.">Detection of calcium sparks in intact and permeabilized skeletal muscle fibers.</a> Methods Mol. Biol. 798, 395-410 (2012).</li><li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SparkMaster:+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ.">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 293 (3), 1073-1081 (2007).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+aging+is+associated+with+compromised+Ca2++spark+signaling+and+segregated+intracellular+Ca2++release.">Muscle aging is associated with compromised Ca2+ spark signaling and segregated intracellular Ca2+ release.</a> J. Cell. Biol. 174 (5), 639-645 (2006).</li><li>Weisleder, N., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Ca2++sparks+in+aging+skeletal+and+cardiac+muscle.">Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle.</a> Ageing Res. Rev. 7 (3), 177-188 (2008).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+uptake+regulates+rapid+calcium+transients+in+skeletal+muscle+during+excitation-contraction+(E-C)+coupling.">Mitochondrial calcium uptake regulates rapid calcium transients in skeletal muscle during excitation-contraction (E-C) coupling.</a> J. Biol. Chem. 286 (37), 32436-32443 (2011).</li><li>Tjondrokoesoemo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+inositol+(1,4,5)-trisphosphate+receptor+activates+ryanodine+receptor+1+to+mediate+calcium+spark+signaling+in+adult+Mammalian+skeletal+muscle.">Type 1 inositol (1,4,5)-trisphosphate receptor activates ryanodine receptor 1 to mediate calcium spark signaling in adult Mammalian skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 288, 2103-2109 (2013).</li><li>Martins, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+contribute+to+Ca2++signals+produced+by+osmotic+stress+in+mouse+skeletal+muscle+fibres.">Reactive oxygen species contribute to Ca2+ signals produced by osmotic stress in mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 586 (1), 197-210 (2008).</li><li>Apostol, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+calcium+signals+induced+by+hyper-osmotic+stress+in+mammalian+skeletal+muscle+cells.">Local calcium signals induced by hyper-osmotic stress in mammalian skeletal muscle cells.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 30 (3-4), 97-109 (2009).</li><li>Jiang, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acid+adenine+dinucleotide+phosphate+(NAADP)+Activates+Global+and+Heterogeneous+Local+Ca2++Signals+from+NAADP-+and+Ryanodine+Receptor-gated+Ca2++Stores+in+Pulmonary+Arterial+myocytes.">Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) Activates Global and Heterogeneous Local Ca2+ Signals from NAADP- and Ryanodine Receptor-gated Ca2+ Stores in Pulmonary Arterial myocytes.</a> J. Biol. Chem. 288 (15), 10381-10394 (2013).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שיטה זו של הערכת Ca 2 + ניצוצות בשרירי שלד בשלמותה היא כלי שימושי לפיזיולוגית שרירים ומחקר מחלה. הראינו כי תגובת Ca 2 + הניצוץ שונתה בתנאים שונים, כולל ניוון שרירי 11, הזדקנות 18, 19, כמו גם בטרשת לרוחב amyotrophic 20. המחקר שנערך לאחרונה שלנו חשף ג...

Ca בחינם תאית 2 + ([Ca 2 +] i) הוא שליח משני צדדי וחשוב המווסת את התפקודים תאיים רבים בתאים להתרגש כגון תאי עצב, לב, שלד ושרירים חלקים (לסקירה ראה Stutzmann ו1 Mattson). מוסדר Ca 2 + וגיוס דיבורים צולבים בין reticulum sarcoplasmic (SR) ו-T-אבובית קרומים (TT) הם רגולטורים בסיסיים של פיזיולוגיה שרירים. יתר על כן, שינויים בCa 2 + איתות שהוכחו כמנגנון בסיסי של תפקוד לקוי של התכווצות במחלות שרירים שונות. Ca 2 + ניצוצות מקומיים אירועי Ca 2 + שחרור יסודיים שמקורם הפתיחה של הקולטן ryanodine הערוץ (RyR) על reticulum sarcoplasmic הקרום (SR) 2. בשריר לב, ניצוצות להתרחש באופן ספונטני באמצעות פתיחת ערוץ RyR2 ידי Ca 2 Ca 2 + rele +-InducedASE (CICR) 3-5 מנגנון. בשרירי שלד, RyR1 נשלט בקפידה על ידי חיישן המתח ב6,7 קרום TT. כך Ca 2 + ניצוצות מדוכאים וזוהו רק לעתים נדירות בתנאי מנוחה בסיבי שריר שלד בשלמותה. עד לאחרונה, קרום sarcolemmal הדרוש כדי להיות מופר על ידי שיטות שונות כימיות או מכאניות &quot;הפשטה&quot; לנתק את הדיכוי של חיישן המתח על RyR1 ואיפשר לCa 2 + להצית אירועים כדי להתגלות בשרירי שלד 8,9. שיטה אחת שתוארה קודם לכן permeabilization הנדרש של הקרום של סיבי שריר על ידי saponin חומר ניקוי 10. ב2003, גילו שגם מתח hypoosmotic חולף או מתח hyperosmotic יכול לגרום Ca ההיקפי 2 + ניצוצות סמוכים לממברנה sarcolemmal בסיבי שריר בשלמות 11. שיטה זו מאז שונתה כדי ללמוד את המנגנון ואפנון המולקולריים של Ca 2 + </sup&gt; שחרור ודינמיקת 12-16. כאן אנו מתארים את הפרטים של הגישה הניסויית שלנו לזירוז, זיהוי וניתוח של Ca 2 + ניצוצות בשרירי שלד בשלמותה. אנו מציגים גם התכנית שלנו שהותקן ניצוץ הניתוח שיכול לשמש כדי לכמת את המאפיינים הבסיסיים של Ca 2 + ניצוצות בודדים בשרירי שלד, לדוגמא תדר ניצוץ ומשרעת (Δ F/F0, המשקף את ההסתברות הפתוחה של ערוצי RyR ו Ca 2 + המטען בתוך SR); זמן להגיע לשיא (זמן עלייה) ומשך (FDHM, משך מלא במשרעת חצי מקסימלי) של ניצוצות, כמו גם את ההתפלגות המרחבית של Ca 2 + ניצוצות. בנוסף, אנו מציגים ראיות המקשרת שינו Ca 2 + ניצוצות למדינות השונות pathophysiological בשרירי שלד, כגון ניוון שרירים וטרשת לרוחב amyotrophic. היתרון של שיטה זו כרוך ביכולת למדוד Ca 2 + ביחסית undamתאי בני, במקום להפשיט את סיבי השריר, המאפשרים הקלטה של Ca 2 + ניצוצות בתנאים קרובים יותר לפיסיולוגיים. בנוסף, התכנית המותאמת במיוחד שלנו מספקת חישובים מדויקים יותר של המאפיינים של הניצוץ ביחס לסיבי שריר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:367px;">Dissect out fibers and check muscle integrity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dissection tools -scissors, and fine tip forceps</td>
			<td style="width:111px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW CORNING</td>
			<td style="width:119px;">184 SIL ELAST KIT</td>
			<td style="width:367px;">&#160;Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60-mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become clear, colorless solid substrate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60-mm glass petri dish&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Pyrex</td>
			<td style="width:119px;">3160</td>
			<td>Fiber dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isotonic Tyrode Solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Minimal Ca2+ Tyrode Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hypotonic Tyrode Solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">collagenase type I&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-5138</td>
			<td>Fiber digestion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Fluo-4 AM&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Fluorescent Ca2+ imaging dyes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TMRE</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td>T669</td>
			<td>mitochondrial membrane potential fluorescent dyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delta TPG dishes&#160;</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td style="width:119px;">0420041500C</td>
			<td>35 mm glass bottom dish for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Spark Fit software</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope</td>
			<td style="width:111px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">3 axis micromanipulator</td>
			<td style="width:111px;">Narishige International</td>
			<td style="width:119px;">MHW-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">temperature controllable orbital shaker</td>
			<td style="width:111px;">New Brunswick scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Fiber dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of calcium sparks in intact skeletal muscle fibers

שמירה על האיתות + homeostatic Ca 2 היא תהליך פיסיולוגי בסיסי בתאים חיים. Ca 2 + ניצוצות הם היחידות היסודיים של Ca 2 + האיתות בסיבי השריר המפוספס שמופיעים מקומיים כמאוד 2 אירועי שחרור Ca + מתווכים על ידי קולטן ryanodine (RyR) Ca 2 + לשחרר ערוצים בreticulum sarcoplasmic (SR) בממברנה. הערכה נכונה של השרירים Ca 2 + ניצוצות יכולים לספק מידע על Ca 2 + מאפייני טיפול תאיים של שרירים משורטטים בריאים וחולים. למרות Ca 2 + ניצוצות אירועים נראים בדרך כלל בשריר לב במנוחה, הם נשמרים רק לעתים נדירות במנוחת סיבי שריר שלד, ולכן יש צורך בשיטות להפקת ולנתח ניצוצות בסיבי שריר שלד. המפורטים כאן הוא פרוטוקול ניסוי למדידת Ca 2 + ניצוצות בdigitorm brevis סיבי שריר מכופף מבודד (FDB) באמצעות fluorescent Ca 2 + דדים ומיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. בגישה זו, סיבי FDB מבודדים נחשפים ללחץ hypoosmotic חולף ואחרי חזרה לפתרון פיסיולוגי איזוטוני. בתנאים אלה, Ca 2 + חזק ניצוצות התגובה מזוהה סמוכה לממברנה sarcolemmal בסיבי שריר צעירים ובריאים FDB. Ca 2 + שינה ניצוצות תגובה מזוהה בסיבי שריר שלד dystrophic או בגיל. גישה זו הוכיחה לאחרונה כי איתות מופרדת קרום מעורב דיבורים צולבים בין אינוסיטול (1,4,5)-אדנוזין קולט (IP 3 R) וRyR תורם לCa 2 + ניצוץ הפעלה שברירי שלד. לסיכום, המחקרים שלנו באמצעות לחץ האוסמוטי מושרה Ca 2 + ניצוצות הראו כי תגובה תאית זו משקפת שרירים איתות מנגנון בפיזיולוגיה והזדקנות / מדינות מחלה, כולל מודלים עכבר של ניוון שרירים (MDX עכברים) או טרשת לרוחב amyotrophic (מודל ALS).

מחקרים קודמים הראו כי לחץ hypoosmotic חולף + מושרה Ca ההיקפי 2 ניצוצות בסמוך לממברנה sarcolemmal בסיבי שריר בשלמות 11. איור 1 מציג את התמונות של סיבי שריר בודדים שלמים עם קרום sarcolemmal חלק ופסים ברורים אופייניים. איור 2 מראה Ca הטיפוסי 2 + ניצוצו...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers at JoVE.com

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

שתואר כאן היא שיטה למדידה ישירה ניצוצות סידן, היחידות יסודי של Ca 2 + שחרור מreticulum sarcoplasmic בסיבי שריר שלד בשלמותה. בשיטה זו משתמשת האוסמוטי-תיווך מתח מפעילה של Ca 2 + שחרור מקולט ryanodine בסיבי שריר מבודדים. יכולים להיות מועסק הדינמיקה ויכולת homeostatic של Ca 2 + איתות תאית כדי להעריך את תפקוד שרירים בבריאות ובחוליים.

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

assessment-of-calcium-sparks-in-intact-skeletal-muscle-fibers

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Views.  The Ohio State University Wexner Medical Center.  שתואר כאן היא שיטה למדידה ישירה ניצוצות סידן, היחידות יסודי של Ca 2 + שחרור מreticulum sarcoplasmic בסיבי שריר שלד בשלמותה. בשיטה זו משתמשת האוסמוטי-תיווך מתח מפעילה של Ca 2 + שחרור מקולט ryanodine בסיבי שריר מבודדים. יכולים להיות מועסק הדינמיקה וי...

Video: Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, oxidative stress, apoptosis, aging, mitochondrial encephalomyopathies and drug toxicity. Given this, technologies to measure cardiac mitochondrial function are in demand. One technique that employs an integrative approach to measure mitochondrial function is respirometric oxidative phosphorylation (OXPHOS) analysis.
The principle of respirometric OXPHOS assessment is centered around measuring oxygen concentration utilizing a Clark electrode. As the permeabilized fiber bundle consumes oxygen, oxygen concentration in the closed chamber declines. Using selected substrate-inhibitor-uncoupler titration protocols, electrons are provided to specific sites of the electron transport chain, allowing evaluation of mitochondrial function. Prior to respirometric analysis of mitochondrial function, mechanical and chemical preparatory techniques are utilized to permeabilize the sarcolemma of muscle fibers. Chemical permeabilization employs saponin to selectively perforate the cell membrane while maintaining cellular architecture.
This paper thoroughly describes the steps involved in preparing saponin-skinned cardiac fibers for oxygen consumption measurements to evaluate mitochondrial OXPHOS. Additionally, troubleshooting advice as well as specific substrates, inhibitors and uncouplers that may be used to determine mitochondria function at specific sites of the electron transport chain are provided. Importantly, the described protocol may be easily applied to cardiac and skeletal tissue of various animal models and human samples.

Saponin-permeabilized fiber preparation in conjunction with respirometric oxidative phosphorylation analysis provides integrative assessment of mitochondrial function. Mitochondrial respiration in physiological and pathological states can reflect various regulatory influences including mitochondrial interactions, morphology and biochemistry.

הערכה Respirometric זרחון חמצוני ב-Saponin permeabilized סיבים לב

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

הערכת Vivo לשעבר של התכווצות, ועיפנות Alternans בשרירי שלד מבודדים

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches involve either differentiating myogenic progenitor cells into immature myotubes or the short-term ex vivo culture of isolated individual muscle fibers. A key benefit of ex vivo culture over in vitro is the retention of the complex cellular architecture and contractile characteristics. Here, we detail an experimental protocol for the isolation of intact flexor digitorum brevis muscle fibers from mice and their subsequent ex vivo culture. In this protocol, muscle fibers are embedded in a fibrin-based and basement membrane matrix hydrogel to immobilize the fibers and maintain their contractile function. We then describe methods to assess the muscle fiber contractile function using an optics-based, high-throughput contractility system. The embedded muscle fibers are electrically stimulated to induce contractions, after which their functional properties, such as sarcomere shortening and contractile velocity, are assessed using optics-based quantification. Coupling muscle fiber culture with this&#160;system allows for high-throughput testing of the effects of pharmacological agents on contractile function and ex vivo studies of genetic muscle disorders. Finally, this protocol can also be adapted to study dynamic cellular processes in muscle fibers using live-cell microscopy.

Skeletal muscle function can be assessed by quantifying the contractility of isolated muscle fibers, traditionally using laborious, low-throughput approaches. Here, we describe an optics-based, high-throughput method to quantify the contractility of hydrogel-embedded muscle fibers. This approach has applications for drug screening and therapeutic development.

מדידות כיווץ בתפוקה גבוהה של סיבי שריר עכבר שלמים המשובצים בהידרוג'ל באמצעות מערכת מבוססת אופטיקה

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches ...

פלואורומטריה תפקודית מכוונת אתר בתאי שריר שלד מקומיים

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, including voltage-gated ion channels. This approach has been used primarily in heterologous expression systems to simultaneously measure membrane currents, the electrical manifestation of the channels&#39; activity, and fluorescence measurements, reporting local domain rearrangements. Functional site-directed fluorometry combines electrophysiology, molecular biology, chemistry, and fluorescence into a single wide-ranging technique that permits the study of real-time structural rearrangements and function through fluorescence and electrophysiology, respectively. Typically, this approach requires an engineered voltage-gated membrane channel that contains a cysteine that can be tested by a thiol-reactive fluorescent dye. Until recently, the thiol-reactive chemistry used for the site-directed fluorescent labeling of proteins was carried out exclusively in Xenopus oocytes and cell lines, restricting the scope of the approach to primary non-excitable cells. This report describes the applicability of functional site-directed fluorometry in adult skeletal muscle cells to study the early steps of excitation-contraction coupling, the process by which muscle fiber electrical depolarization is linked to the activation of muscle contraction. The present protocol describes the methodologies to design and transfect cysteine-engineered voltage-gated Ca2+ channels (CaV1.1) into muscle fibers of the flexor digitorum brevis of adult mice using in vivo electroporation and the subsequent steps required for functional site-directed fluorometry measurements. This approach can be adapted to study other ion channels and proteins. The use of functional site-directed fluorometry of mammalian muscle is particularly relevant to studying basic mechanisms of excitability.

Author Spotlight: Functional Site-Directed Fluorometry in native cells to study skeletal muscle exciability  

Functional site-directed fluorometry is a method to study protein domain motions in real time. Modification of this technique for its application in native cells now allows the detection and tracking of single voltage-sensor motions from voltage-gated Ca2+ channels in murine isolated skeletal muscle fibers.

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר בתאים מקומיים לחקר עוררות שרירי השלד

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, ...

כימות חדירת שומן בשרירי השלד באמצעות דה-צלולריזציה

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

מחבר זרקור: כימות מבוסס דה-צלולריזציה של חדירת שומן בשרירי השלד  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.