עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R37 AI34867 וR01 GM064625 לNWA אנו מודים לד&quot;ר ר &#39;Tweten מאוניברסיטת אוקלהומה לביטוי פלסמיד SLO.

1. תעתיק השתקה של ASM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים 1.5 x 10 5 תאי הלה ב2 מיליליטר של תקשורת צמיחת DMEM (גלוקוז גבוהה DMEM עם 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, 1% פן סטרפטוקוקוס) על מנות תחתית כוס 35 מ&quot;מ (MatTek) ו דגירה לילה בשעה 37 מעלות צלזיוס חממת 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלאחר מכן, לשאוב את תקשורת הצמיחה ולהחליף אותו עם מדיום DMEM 2 מיליליטר מופחת סרום (DMEM עם 4% FBS), שעה לפחות 1 לפני הוספת תערובת transfection siRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4 צינורות לתערובת transfection אוליגו siRNA. בצינורות A ו-C, להוסיף סרום מופחת 250 OptiMEM μl ו4 μl Lipofectamine RNAiMax, ל35 מנה מ&quot;מ להיות transfected. בצינור B, להוסיף 250 μl של OptiMEM מופחת סרום ו8 μl (160 pmoles) השליטה אוליגו תוכן GC הבינוני (הבקרה siRNA), ל35 מנה מ&quot;מ להיות transfected. בצינור D, להוסיף 250 μl של OptiMEM מופחת סרום ו8 μl (160 pmoles) של אוליגו SMPD1 (siASM), ל35 לא מנה מ&quot;מo להיות transfected. דגירה הצינורות בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב צינורות A ו-B ליצירת מורכב transfection לבקרה siRNA, וצינורות C ו-D לsiRNA ASM. דגירה התגובות בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את תערובות הבקרה siRNA ו ASM siRNA תגובת transfection לאט, dropwise, למאכלי תחתית כוס 35 מ&quot;מ המתאים ולדגור על 37 ° C / 5% CO 2. ב24 לאחר transfection שעות, לשאוב בעדינות את תקשורת ולהחליף עם תקשורת צמיחת DMEM טרי. למציאת ASM יעילה, המנות צריכה להיות מודגרות נוספות על 37 ° C / 5% CO 2 למשך כשעות ביום 31 (סה&quot;כ 55 hr) לפני הדמיה בשידור חי. </li></ol> 2. הכנת ריאגנטים לחיים מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של הרעלן יוצרים הנקבובית רקומביננטי Streptolysin O (SLO) בריכוז של 100 ng / μl בקור 1x PBS ללא Ca 2 + ו Mg 2 +. SLO בשימוש במבחנים אלה הוא constitutivelהמוטציה y פעילה ציסטאין שאינו דורשת צמצום סוכנים לפעילות, ובלבד באדיבות על ידי ד&quot;ר רוד Tweten, אוניברסיטת אוקלהומה. רעלן בא לידי ביטוי בE. coli BL21 DE3 ומטוהר בתנאים מקומיים, כפי שתואר לעיל 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון מניות FM1-43: FM1-43 אבקת lyophilized Resuspend ב DMSO כדי ליצור פתרון 25 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון: לדלל את פתרון מניות FM1-43 בDMEM הקר עם Ca 2 + לריכוז סופי של 4 מיקרומטר (1.5 מיליליטר יש צורך לכל צלחת MatTek) ולאחסן על קרח עד צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון ב &#39;: לדלל את פתרון מניות FM1-43 בDMEM הקר ללא Ca 2 + ו10 מ&quot;מ EGTA (Ca 2 + ללא DMEM) לריכוז סופי של 4 מיקרומטר (1.5 מיליליטר דרוש לכל צלחת MatTek) ולאחסן על קרח עד צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם (37 מעלות צלזיוס) 1 מיליליטר aliquots של הפתרון ופתרון B בצינורות Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על פתרונות קרח של DMEM עם Ca 2 +, ו-CDMEM 2 ללא +. </li></ol> 3. תא חי הדמיה של פליטה FM1-43 לSLO מטופלים ותאים שלא טופלו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מיכל מתכת רדוד בגודל בינוני עם קרח כתוש, להפוך אותו למכל זכוכית גדול עם קרח, ולהוסיף קרח נוסף עוזב את המשטח התחתון בלבד של מיכל המתכת החשוף. הנח מגבת נייר רטובה בתחתית המתכת חשופה, כדי לאפשר העברה אפילו תרמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח אחד מנה שטופל siRNA הבקרה MatTek (לדוגמא 1) ולמקם אותו במגבת נייר הרטובה והקרה. בעדינות לשאוב את כל המדיה ולשטוף 3x עם Ca 2 DMEM + ללא קר. לאחר השטיפה האחרונה, לשאוב את כל אמצעי התקשורת בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתמונה הקשורים תא FM1-43 בתאים ללא פציעת SLO (לדוגמא 1) בנוכחות של Ca 2 +, להוסיף 180 μl של פתרון קר &#39;לcoverslip זכוכית מרכז צלחת הזכוכית התחתונה 35 מ&quot;מ ודגירה של 5 דקות על קרח (טבלה 1). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת MatTek על הבמה של מיקרוסקופ confocal מחומם ל37 מעלות צלזיוס ומצוידים בתא סביבתי (ששומר על טמפרטורה, לחות ו2 רמות CO). מצא את תחום התאים שיהיו צילמו מחפשים דרך אובייקטיבי 1.3 40X NA (ניקון). אם זמין, הפעל את PerfectFocus או מכשיר דומה כדי לתקן את סחיפה תרמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של פתרון prewarmed בעדינות לצד השני של צלחת 35 מ&quot;מ ולהחליף את הכיסוי של תא סביבתי (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות למשך 4 דקות במסגרת 1 כל 3 שניות באמצעות תוכנת הדמיה מתאימה (Volocity במערכת מיקרוסקופיה confocal הדיסק מסתובב UltraView ווקס פרקין אלמר). עירור של FM1-43 מושגת באמצעות קו לייזר 488 ננומטר באמצעות מסנן dichroic עם להקה לעבור 488 ננומטר, ואפליה פליטה מושגת באמצעות שימוש במסנן 527 פליטה (W55). רמות כוח הלייזר ורגישות מצלמה נקבעות על מנת להשיג חשיפת תמונה של 100 אלפיות שניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.2-3.6 לזהות FM1-43 בתאים שטופלו ב-siRNA בקרה ללא פציעת SLO (דוגמא 2) בהעדר Ca 2 +, חוץ מזה ב3.5 פתרון B צעד יש להוסיף (טבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את זרם FM1-43 לתאים שטופלו ב-siRNA הבקרה פצוע עם SLO או בנוכחות (לדוגמא 3) או העדרה של Ca 2 + (דוגמא 4), להוסיף 180 μl של פתרון ב &#39;קר המכיל SLO לcoverslip זכוכית מרכז צלחת 35 מ&quot;מ זכוכית תחתונה ודגירה במשך 5 דקות על קרח כמו בשלב 3.3. חזור על שלבים 3.2 דרך 3.6; להתאים הוספה או פתרון או פתרון B בשלב 3.5 (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את תפקידו של ASM בתיקון קרום פלזמה, חזור על שלבים 3.2-3.6 שימוש בתאים שטופלו siRNA ASM לכל התנאים (דוגמאות 5-8) (טבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את תפקידו של sphingomyelinase תאי רקומביננטי (SM) עלקינטיקה של תיקון קרום פלזמה (באה לידי ביטוי בעיכוב בזרם FM1-43) (דוגמאות 9-10), SM מתווספת (0-50 μU) לאו פתרון או פתרון B בשלב 3.5 ולאחר מכן הוסיף לתאים במהלך תא חי הדמיה בנפח כולל של 1 מיליליטר (טבלת 1). </li></ol> 4. כימות פליטת FM1-43 לתוך תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הסרטים נרכשו, למדוד את עוצמת הקרינה תאית של FM1-43 באמצעות תוכנת ניתוח תמונה (Volocity Suite, PerkinElmer). צייר אזור של עניין באזור cytosolic של כל תא בתחום וליישם את כלי תוכנה כדי לקבוע את עוצמת הקרינה FM1-43 הממוצעת בכל המסגרות של הווידאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתאים לשינויים בכתמי FM1-43 הראשוניים, הנתונים עבור כל סרטון וידאו מתבטא כגידול של פי בעוצמת הקרינה לאורך זמן, ולהתוות לכל מצב אחר. הגידול של פי בקרינה של כל timepoint הבודד לכלתא מחושב כF T / 0 F, כאשר F T הוא הקרינה הממוצעת בtimepoint הספציפי, וF 0 הוא הקרינה הממוצעת בזמן t = 0 (איורים 1-2). </li></ol>

<ol>
	<li>Heilbrunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The dynamics of living protoplasm. , (1956).</li><li>Chambers, R., Chambers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Explorations into the nature of the living cell. , (1961).</li><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing.">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li><li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption.">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li><li>Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+resealing+by+a+vesicular+mechanism+similar+to+neurotransmitter+release.">Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release.</a> Science. 263, 390-393 (1994).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane.">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li><li>Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+facilitated+cell+membrane+resealing.">The mechanism of facilitated cell membrane resealing.</a> J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).</li><li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomes+behave+as+Ca2+-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells.">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).</li><li>Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2+-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li><li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells.">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li><li>Chakrabarti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+membrane+resealing+and+autoimmune+myositis+in+synaptotagmin+VII-deficient+mice.">Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice.</a> J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pore+formation:+an+ancient+yet+complex+form+of+attack.">Pore formation: an ancient yet complex form of attack.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).</li><li>Morgan, B. P., Campbell, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recovery+of+human+polymorphonuclear+leucocytes+from+sublytic+complement+attack+is+mediated+by+changes+in+intracellular+free+calcium.">The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium.</a> Biochem. J. 231, 205-208 (1985).</li><li>Keefe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin+triggers+a+plasma+membrane-repair+response+that+facilitates+CTL+induction+of+apoptosis.">Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis.</a> Immunity. 23, 249-262 (2005).</li><li>Idone, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+injured+plasma+membrane+by+rapid+Ca2+-dependent+endocytosis.">Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Tam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+of+acid+sphingomyelinase+by+wounded+cells+promotes+endocytosis+and+plasma+membrane+repair.">Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair.</a> J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems.">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).</li><li>Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol-dependent+cytolysins,+a+family+of+versatile+pore-forming+toxins.">Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins.</a> Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).</li><li>Zha, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomyelinase+treatment+induces+ATP-independent+endocytosis.">Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).</li><li>Buckley, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+three+membranes.+Channel+formation+by+aerolysin.">Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin.</a> FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).</li><li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Aeromonas+toxin+proaerolysin+in+its+water-soluble+and+membrane-channel+states.">Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states.</a> Nature. 367, 292-295 .</li><li>Yamaji-Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+and+pore+formation+of+a+sphingomyelin-specific+toxin,+lysenin.">Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin.</a> J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מחקרים קודמים על תיקון פגיעה וקרום פלזמה מכאני הסתמכו על מנגנונים שונים של תאים ופצעו, החל מהטלת חרוזי זכוכית, micropipetting, גז, שריטות או גירוד. את ההודעה של כל מבחני האלה היה איכותיים ולא כמוני, ולא לתת מידע מדויק על קינטיקה של מנגנון התיקון. היכולת של תאי reseal קרום הפלזמה ?...

זה כבר ידוע במשך כמה עשורים שתיקון קרום פלזמה לאחר פגיעה מכאנית הוא 1,2 Ca 2 + תלוי תהליך. מאוחר יותר מחקרים הראו כי זרם Ca 2 + דרך הפצע מפעיל תהליך נמרץ של exocytosis של שלפוחית ​​תאית באתר של פציעה, אשר נדרש לresealing 3,4. שיעור ההפסד של צבע פלואורסצנטי נטען לתוך הציטופלסמה של תאים שימש להערכה מהירה של תיקון, והגיע למסקנה כי resealing הושלם בתוך &lt;30 שניות לאחר פציעה 5. שני דגמים בתחילה הוצעו כדי להסביר את הדרישה לexocytosis בתיקון קרום פלזמה: 1) מודל &quot;התיקון&quot;, שהציע כי Ca 2 + זרם דרך הנגע מפעיל היתוך תחילה homotypic של שלפוחית ​​תאית, ויוצר &quot;תיקון&quot; גדול שהיית לאחר מכן ניתן יהיה להחיל את קרום הפלזמה ללאטום את הפצע 6 ו 2) מודל הפחתת מתח, אשר הציע כי adde הקרוםד על ידי 2 exocytosis + תלוי Ca באזור הפצע הייתי להפחית את מתח קרום פלזמה, בהנחיית הודבקה מכתבים מחדש של bilayer 7. התפקיד של 2 exocytosis + מופעל-Ca בתיקון קרום פלזמה התחזק עוד יותר על ידי מחקרים המראים כי lysosomes מכיל מולקולת Ca 2 + חיישן, synaptotagmin שביעי, המאפשרת exocytosis ותיקון קרום פלזמה בתאים נפצעו 8,9,10,11 . עם זאת, ראיות נוספות ציינו כי exocytosis לבד לא הייתה מספיק כדי לקדם את תיקון קרום פלזמה. בנוסף לדמעות מכאניות על קרום הפלזמה, צורה שכיחה של פגיעה בתא היא permeabilization ידי רעלים יוצרים נקבוביות המיוצרים על ידי חיידקים 12,13 או תאים חיסוניים 14,15. שלא כמו דמעות מכאניות, חלבוני יוצרים נקבוביות להכניס את עצמם בקרום הפלזמה יוצרים נקבובית שלא ניתן resealed פשוט על ידי יישום &quot;תיקון&quot; קרום או על ידי reduc יציב, מרופד בחלבוןing מתח קרום. מסקרן, מחקרים גילו כי יש לי תאי יונקים מנגנון יעיל כדי לתקן את קרום הפלזמה שלהם לאחר permeabilization עם חלבוני יוצרים נקבוביות, ותהליך זה דורש גם את הנוכחות של Ca 2 + 12 תאיים. ממצא זה העלה את השאלה האם ההסרה נקבובית הטרנסממברני מתא השטח הייתה גם תהליך מהיר, כפי שנצפה עם פצעים מכאניים 5. באופן מפתיע, המחקרים האחרונים שלנו גילו כי הודבק המכתבים מחדש של תאי permeabilized עם רעלים יוצרים נקבוביות יש מאפיינים דומים מאוד לתיקון של פצעים מכאניים: התהליך דורש תאי Ca 2 +, והוא יושלם תוך ~ 30 שניות. חוקר את התהליך הזה בפירוט רב יותר, נודע לנו לאחרונה כי בנוסף לCa 2 + exocytosis המוסדר של lysosomes, תיקון קרום פלזמה כרוך צורה מהירה של אנדוציטוזה, אשר מופעלת על ידי שחרורו של lysosomal אנזים sphingomyelinase חומצה (ASM) והוא חיוני לא רק עבור ההסרת דואר של נקבוביות הטרנסממברני, אלא גם לתיקון של פצעים מכאניים 16. כדי לקבוע את קינטיקה של תא הודבק מכתבים מחדש לאחר permeabilization עם חלבוני יוצרים נקבוביות, במעבדה שלנו אנו הותאמו המתודולוגיה הדמיה חיה שהיה בשימוש בעבר כדי להעריך הודבק מכתבים מחדש של סיבי שריר מבודדים-נפצע לייזר 17. assay זה מסתמך על מאפיינים של הצבע lipophilic FM1-43, שintercalates יציבות לעלון החיצוני של bilayers שומנים וגוברים בעוצמת הקרינה. כאשר bilayer קרום הפלזמה מופר מקבלת גישה לצבוע תאית לקרומים תאיים, מתן assay רגיש כדי לזהות פציעת קרום פלזמה ולתקן 18,16,19,20. להסתגל assay זה להערכת הודבק מכתבים מחדש תא לאחר permeabilization עם חלבוני יוצרים נקבוביות, אנו מראש מודגרות-תאים ב 4 ° C עם O חיידקי streptolysin רעלן (SLO), אשר נקשר לכולסטרול קרום 21. תא סינכרוניpermeabilization אז יכול להיות מושגת בקלות על ידי הזזת התאים מקרח להתחמם בינוני בבמת מיקרוסקופ מחוממת, אשר מפעילה את oligomerization ושינוי בקונפורמציה שמוביל לtransmembrane היווצרות נקבובית. יתרון של גישה זו, על מבחני שפורסמו בעבר באמצעות פציעת לייזר, הוא שמספר גדול יותר של תאים ניתן לנתח בו זמנית בשדה מיקרוסקופי, מתן דגימה טובה יותר של אוכלוסיית התאים. בהתחשב בדמיון מכניסטית בין התהליך הודבק מכתבים מחדש תא ראה לאחר פציעה מכאנית וpermeabilization עם רעלים יוצרים נקבוביות, assay אנו מתארים כאן מספק שיטה מאוד תכליתית ורבה עוצמה עבור לנתח גורמים מעורבים בתהליך היסודי של תיקון קרום פלזמה. כדוגמא, אנו מראים כי ניתן להשתמש assay זה לזהות צעדי Ca 2 + תלויים ובלתי תלויים בתהליך התיקון.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HeLa 229 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL2-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose No Calcium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20168</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3163</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Optimem Reduced Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Control medium GC content RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12935300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SMPD1 RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HSS143988</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat-inactivated</td>
			<td>Gemini-Bioproducts</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sphingomyelinase from Bacillus cereus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7651</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm-glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-14</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C9100-50</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>UltraViewVoX</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Volocity Suite</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Pathology Devices</td>
			<td>LiveCell System Chamber</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live imaging assay for assessing the roles of ca2+ and sphingomyelinase in the repair of pore-forming toxin wounds

פציעת קרום פלזמה היא אירוע תכוף, ופצעים צריכים להיות מתוקנים במהירות כדי להבטיח את הישרדות סלולרית. זרם של Ca 2 + הוא אירוע איתות מרכזי שמפעיל את התיקון מפצעים מכאניים על קרום הפלזמה בתוך ~ 30 שניות. מחקרים שנעשה לאחרונה גילו כי בתאי יונקים גם לאטום קרום הפלזמה שלהם לאחר permeabilization עם נקבובית ויוצר רעלים בCa 2 + תלוי תהליך שכרוך exocytosis של sphingomyelinase חומצת אנזים lysosomal אחרי אנדוציטוזה הנקבובית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ששמשה כדי להדגים שהודבק המכתבים מחדש של תאי permeabilized ידי O streptolysin הרעל הוא גם מהירים ותלויים Ca 2 + זרם. עיצוב assay מאפשר סינכרון של אירוע פציעה ומדידה קינטית מדויקת של היכולת של תאים כדי לשחזר את שלמות קרום פלזמה על ידי הדמיה וכימותים על ידי שצבע liphophilic FM1-43 מגיע קרומים תאיים המידה. als assay החי זהo מאפשרת הערכה רגישה ליכולתה של אקסוגני הוסיפה גורמים מסיסים כגון sphingomyelinase לעכב זרם FM1-43, המשקפת את היכולת של תאים לתיקון קרום הפלזמה שלהם. assay זה אפשר לנו להראות בפעם הראשונה שsphingomyelinase פועל במורד הזרם של 2 exocytosis + תלוי Ca, שכן בנוסף תאי של האנזים מקדם הודבק מכתבים מחדש של תאי permeabilized בהעדר Ca 2 +.

ריכוזים נמוך של תיקון קרום פלזמה הצלת sphingomyelinase (SM) חיידקים בתאים מדולדלים בsphingomyelinase חומצת lysosomal. באמצעות assay ההדמיה FM1-43, הראינו בעבר כי תאים לקויים לASM אנזים lysosomal ונחשפו לSLO פצע בנוכחות של Ca 2 + להיות בעל מום קרום פלזמה הוא חולץ ?...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds at JoVE.com

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

הדמיה חיה של תאים שנחשפו לצבע lipophilic FM1-43 מאפשרת קביעה מדויקת של קינטיקה שבו רעלים יוצרים נקבוביות יוסרו מקרום הפלזמה. זה assay רגיש שיכול לשמש כדי להעריך את הדרישות לCa 2 +, sphingomyelinase וגורמים אחרים על תיקון קרום פלזמה.

לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; וSphingomyelinase בתיקון פצעי רעלן נקבובית יוצרי

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

live-imaging-assay-for-assessing-roles-ca2-sphingomyelinase-repair

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

11.6K Views.  University of Maryland.  הדמיה חיה של תאים שנחשפו לצבע lipophilic FM1-43 מאפשרת קביעה מדויקת של קינטיקה שבו רעלים יוצרים נקבוביות יוסרו מקרום הפלזמה. זה assay רגיש שיכול לשמש כדי להעריך את הדרישות לCa 2 +, sphingomyelinase וגורמים אחרים על תיקון קרום פלזמה. 

Video: Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

טכניקות הדמיה Ca 2 + איתות זרע אנושי

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

אלקטרונים ספין תהודה מיקרו הדמיה המינים Live עבור מיפוי חמצן

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

תא חי סידן הדמיה בשילוב עם השתקת siRNA מתווכת ג&#39;ין מזהה Ca 2 + ערוצי דליפה בקרום ER ו מנגנוני ויסות שלהם

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Assay Explant להערכת התנהגות ניידת של mesenchyme הגולגולת

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...