טכניקת הבהירות שתוארה לראשונה בשנת 2013 היא טכניקת ניקוי רקמות המאפשרת דגימות של כמויות גדולות יותר של תאים, כלי דם, כך שאפילו חלבונים כאלה ברזולוציה של תא בודד בפרוסות מוח עבות. טכניקה זו מאפשרת לחקור מבנים מיקרוסקופיים שלמים על ידי הפיכת המוח כולו לשקוף. פרוטוקול זה הוא שבב פשוט וצינור פשוט עבור רקמות ברורות.
טכניקה זו יכולה לשמש לפינוי רקמות במערכות אחרות בנוסף לרקמות המוח. כדי להתחיל, אטמו את הצינור ואת המכסה באמצעות פרפילם ונקבו שני חורים בכובע. לאחר מכן להעביר גז חנקן מהמיכל באמצעות צינור גמיש עם קוטר פנימי של חמישה מילימטרים ומחט של 19 מד המחוברת בקצהו.
התחילו לגזע על ידי חיבור הצינור לצינור ואפשרו חילופי גזים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. נתקו את הצינור ומיד אטמו את החורים בחימר דוגמנות. לאחר מכן מעבירים את הצינורות האטומים של דגה לאמבטיה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 1/2 שעות כדי לפלמל את תמיסת ההידרוג'ל.
הוציאו את המוח מהצינור. באמצעות מגבוני מעבדה, הסר את ההידרוג'ל הפולימרי סביב המוח כדי להבטיח שלא יישארו שאריות ג'ל מחוברות לפני השטח של המוח. חלקו את המוח לפרוסות עבות המכילות את כל תחומי העניין.
מכניסים את הפרוסות לתמיסת הניקוי הראשונה ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-70 סל"ד למשך 24 שעות. בינתיים, הכינו צינור מחורר כדי למקם את המוח. שים את הצינור המחורר בכוס מלאה בתמיסת ניקוי שנייה במכשיר ערבוב.
לאחר מכן הניחו את המוח בכוס ואטמו אותו בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנה. לאחר שהרקמה הופכת שקופה, העבירו את המוח ל-PBST באינקובציה ב-37 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-70 סל"ד למשך 24 שעות. החליפו את התמיסה ב-PBST טרי והמשיכו את הדגירה עוד 24 שעות.
לאחר מכן העבירו את המוח ל-PBS בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, הסר את המוח מ- PBS והעבר אותו לתמיסת התאמת מקדם שבירה. הדגירה של המוח ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
ראשית, מקם את הדגימה באמצע השקופית. באמצעות דבק חם, ליצור קירות בשולי המגלשה, כמעט כמו הרקמה. הקפידו להשאיר פער קטן באחת הפינות.
כאשר שכבת הדבק החם מתקרבת לגובה פרוסת המוח, יש למרוח אחת עד שתי טיפות של תמיסת התאמת מקדם השבירה על הדגימה כדי להרטיב את המשטח העליון ולמנוע היווצרות בועות. בזמן שהדבק החם עדיין נוזלי, אטמו את החלקה העליונה בהחלקת כיסוי, הניחו אותו באופן שווה ככל האפשר ואז מלאו את התא בתמיסת ההתאמה של מקדם השבירה. סגרו את הפער בדבק חם.
אם דפנות הדבק החם משתרעות מעבר לגבולות המגלשה, חתכו את הקצוות המתרחבים. אם מטרת טבילת שמן משמשת להדמיה, הוסיפו עוד שניים עד שלושה מילימטרים של דבק לקירות שמעל החלקת הכיסוי כדי לשמור על תמיסת הטבילה. לאחר פרוטוקול זה, רקמת המוח תפונה.
פרוסות מוח ברורות הוכנו באמצעות פרוטוקול זה כדי לדמיין אוכלוסיות של אסטרוציטים ותאי עצב באזור CA1 של היפוקמפוס עכבר. כל האסטרוציטים ביטאו tdTomato ותאי עצב מעוררים ביטאו H2B-GFP בגרעינים שלהם. התא שהוכן עבור הרקמה המובהקת היה אופטימלי להדמיה תחת שני פוטון או מיקרוסקופ קונפוקלי.
באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים, נצפו יותר מ-300 אסטרוציטים בקטע מנוקה של אזור CA1 של היפוקמפוס העכבר. האסטרוציטים ההיפוקמפוסים בתאים אדומים ופירמידאליים, סומטה בירוק היו גלויים ועבים, רקמה שקופה המייצגת את הקרבה המרחבית בין שני סוגי התאים הללו. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לייזר סורק, צרורות אקסונאליים מתאי עצב מעוררים אותרו על פני חצי כדור שלם.
צרורות ירוקים אותרו מההיפוקמפוס הגבי לעבר הגופות הסופר-מימיות. הצרורים האדומים אותרו מגופי המאמילרים לעבר מקורם בהיפוקמפוס האוורור. גורמים, כגון טמפרטורה, ריכוזים וזמן דגירה השפיעו על תוצאות הליך הבהירות.
לכן, הדיוק בכל שלב של הפרוטוקול חיוני להצלחת השגת רקמה ברורה. באמצעות טכניקה זו, אנו מודדים את המרחקים בין נוירונים לאסטרוציטים בכמה מבני מוח. פרוטוקול זה איפשר ניתוח של שניים עד שלושה סדרי גודל של יותר תאים מאשר במחקרים קודמים.
