A técnica de clareza descrita pela primeira vez em 2013 é uma técnica de limpeza tecidual que permite a amostragem de maiores quantidades de células, vasos sanguíneos, de modo que mesmo proteínas como uma resolução celular única em fatias cerebrais grossas. Esta técnica permite o estudo de estruturas microscópicas intactas, tornando todo o cérebro transparente. Este protocolo é um simples chip e um pipeline simples para limpar tecidos.
Esta técnica pode ser usada para limpar tecidos em outros sistemas, além de tecidos cerebrais. Para começar, sele o tubo e a tampa usando parafilme e puna dois furos na tampa. Em seguida, transfira gás nitrogênio do tanque usando um tubo flexível com cinco milímetros de diâmetro interno e uma agulha de calibre 19 conectada em sua extremidade.
Comece a desgasear anexando o tubo ao tubo e permitindo a troca de gás por 30 minutos em temperatura ambiente. Retire o tubo e sele imediatamente os orifícios com argila modeladora. Em seguida, transfira os tubos selados de degas para um banho Celsius de 37 graus por 3 horas e meia para polimerizar a solução de hidrogel.
Tire o cérebro do tubo. Usando lenços de laboratório, remova o hidrogel polimerizado ao redor do cérebro, garantindo que nenhum gel residual permaneça ligado à superfície do cérebro. Divida o cérebro em fatias grossas que contenham todas as áreas de interesse.
Coloque as fatias na primeira solução de compensação e incubar a 37 graus Celsius com rotação a 70 RPM por 24 horas. Enquanto isso, prepare um tubo perfurado para colocar o cérebro. Coloque o tubo perfurado em um béquer preenchido com segunda solução de compensação em um dispositivo de agitação.
Em seguida, coloque o cérebro no béquer e sele-o com papel alumínio para evitar branqueamento. Depois que o tecido se tornar transparente, transfira o cérebro para PBST em incubar a 37 graus Celsius com rotação a 70 RPM por 24 horas. Substitua a solução por PBST fresco e continue a incubação por mais 24 horas.
Em seguida, transfira o cérebro para PBS em temperatura ambiente por 24 horas. Após 24 horas, remova o cérebro da PBS e transfira-o para uma solução de correspondência de índices refrativos. Incubar o cérebro a 37 graus Celsius durante a noite.
Primeiro, coloque a amostra no meio do slide. Usando cola quente, crie paredes nas bordas do escorregador, quase tão alto quanto o tecido. Certifique-se de deixar uma pequena lacuna em um dos cantos.
À medida que a camada de cola quente se aproxima da altura da fatia cerebral, aplique uma a duas gotas da solução de correspondência de índice refrativo na amostra para umedecer a superfície superior e evitar a formação de bolhas. Enquanto a cola quente ainda é líquida, sele a parte superior com um deslizamento de tampa, colocando-a o mais uniformemente possível e, em seguida, encha a câmara com a solução de correspondência de índice refrativo. Feche a lacuna com cola quente.
Se as paredes de cola quente se estenderem além das bordas do slide, corte as bordas de extensão. Se um objetivo de imersão em óleo for usado para imagens, adicione mais dois a três milímetros de cola às paredes acima do deslizamento da tampa para manter a solução de imersão. Após este protocolo, o tecido cerebral será limpo.
Fatias cerebrais claras foram preparadas usando este protocolo para visualizar populações de astrócitos e neurônios na região ca1 do hipocampo de camundongos. Todos os astrócitos expressaram tdTomato e neurônios excitatórios expressaram H2B-GFP em seus núcleos. A câmara preparada para o tecido esclarecido foi ideal para imagens sob um microscópio de dois fótons ou confocal.
Usando um microscópio de dois fótons, mais de 300 astrócitos foram observados em uma seção desmatada da região ca1 do hipocampo do rato. Os astrócitos hipocampais em células vermelhas e piramidais, somata em verde eram visíveis e grossos, tecido transparente representando a proximidade espacial entre esses dois tipos de células. Usando um microscópio confocal a laser de varredura, feixes axonais de neurônios excitatórios foram rastreados por todo um hemisfério.
Feixes verdes foram rastreados do hipocampo dorsal em direção aos corpos super mamillários. Os feixes vermelhos foram rastreados dos corpos mamillary em direção à sua origem no hipocampo de ventilação. Fatores como temperatura, concentrações e tempo de incubação influenciaram o resultado do procedimento de clareza.
Portanto, a precisão em cada etapa do protocolo é vital para o sucesso de alcançar tecido claro. Usando essa técnica, medimos as distâncias entre neurônios e astrócitos em várias estruturas cerebrais. Este protocolo permitiu a análise de duas a três ordem de magnitude mais células do que em estudos anteriores.
