2013 년에 처음 설명 된 선명도 기술은 다량의 세포, 혈관, 심지어 단백질조차도 두꺼운 뇌 조각에서 단일 세포 분해능을 샘플링 할 수있게 해주는 조직 제거 기술입니다. 이 기술은 전체 뇌를 투명하게 만들어 손상되지 않은 현미경 구조를 연구 할 수있게합니다. 이 프로토콜은 간단한 칩과 조직 정리를위한 간단한 파이프 라인입니다.
이 기술은 뇌 조직 외에도 다른 시스템의 조직을 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 시작하려면 파라 필름을 사용하여 튜브와 캡을 밀봉하고 캡에 두 개의 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 내부 직경이 다섯 밀리미터 인 유연한 파이프와 끝에 연결된 19 게이지 바늘을 사용하여 탱크에서 질소 가스를 이송하십시오.
파이프를 튜브에 부착하고 실온에서 30 분 동안 가스 교환을 허용하여 탈기를 시작하십시오. 파이프를 분리하고 즉시 모델링 점토로 구멍을 밀봉하십시오. 그 후 탈가스 밀봉된 튜브를 섭씨 37도 욕조로 3 1/2시간 동안 이송하여 하이드로겔 용액을 중합시킨다.
튜브에서 뇌를 꺼내십시오. 실험실 물티슈를 사용하여 뇌 주위의 중합 된 하이드로 젤을 제거하여 잔류 겔이 뇌 표면에 부착되지 않도록하십시오. 뇌를 모든 관심 영역을 포함하는 두꺼운 조각으로 나눕니다.
슬라이스를 첫 번째 클리어링 용액에 넣고 섭씨 37도에서 24시간 동안 70RPM에서 회전하면서 인큐베이션한다. 그 동안 뇌를 배치하기 위해 천공 된 튜브를 준비하십시오. 천공된 튜브를 교반 장치 상의 초클리어링 용액으로 채워진 비이커에 넣는다.
그런 다음 뇌를 비이커에 넣고 표백을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 밀봉하십시오. 조직이 투명하게 변한 후, 뇌를 PBST로 옮기고 섭씨 37도에서 24시간 동안 70RPM에서 회전하면서 배양한다. 용액을 신선한 PBST로 교체하고 또 다른 24시간 동안 인큐베이션을 계속한다.
그런 다음 뇌를 실온에서 24시간 동안 PBS로 옮긴다. 24시간 후, PBS로부터 뇌를 제거하고 굴절률 매칭 용액으로 옮긴다. 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 뇌를 배양하십시오.
먼저 샘플을 슬라이드 중간에 놓습니다. 뜨거운 접착제를 사용하여 슬라이드 가장자리에 거의 조직만큼 높은 벽을 만듭니다. 모서리 중 하나에 작은 틈새를 남겨 두십시오.
뜨거운 접착제 층이 뇌 조각의 높이에 접근하면 샘플에 굴절률 일치 용액의 한 방울에서 두 방울을 떨어 뜨려 윗면을 적시고 거품 형성을 방지하십시오. 뜨거운 접착제는 여전히 액체이지만 커버 슬립으로 상단을 밀봉하고 가능한 한 고르게 놓은 다음 굴절률 일치 용액으로 챔버를 채 웁니다. 뜨거운 접착제로 틈을 닫으십시오.
뜨거운 접착제 벽이 슬라이드의 테두리 너머로 확장되면 연장 모서리를 자릅니다. 오일 침지 목표를 이미징에 사용하는 경우 커버 슬립 위의 벽에 두 세 밀리미터의 접착제를 더 추가하여 침지 용액을 유지합니다. 이 프로토콜 후에, 뇌 조직은 제거될 것이다.
명확한 뇌 조각은 마우스 해마의 CA1 영역에서 성상세포 및 뉴런의 집단을 시각화하기 위해 이 프로토콜을 사용하여 제조되었다. 모든 성상세포는 tdTomato를 발현하고 흥분성 뉴런은 그들의 핵에서 H2B-GFP를 발현하였다. 정화된 조직을 위해 준비된 챔버는 두 개의 광자 또는 공초점 현미경 하에서 이미징에 최적이었다.
두 개의 광자 현미경을 사용하여, 마우스 해마의 CA1 영역의 클리어 섹션에서 300개 이상의 성상세포가 관찰되었다. 적색 및 피라미드 세포에서의 해마 성상세포, 녹색의 소마타는 이들 두 세포 유형 사이의 공간적 근접성을 나타내는 가시적이고 두껍고 투명한 조직이었다. 스캐닝 레이저 공초점 현미경을 사용하여, 흥분성 뉴런으로부터의 축삭 다발을 전체 반구에 걸쳐 추적하였다.
녹색 번들은 등쪽 해마에서 슈퍼 모성체쪽으로 추적되었습니다. 빨간 뭉치는 모성체에서 통풍구 해마에서 기원을 향해 추적되었습니다. 온도, 농도 및 배양 시간과 같은 요인은 명확성 절차의 결과에 영향을 미쳤습니다.
따라서 프로토콜의 모든 단계에서 정밀도는 명확한 조직을 성공적으로 달성하는 데 필수적입니다. 이 기술을 사용하여 우리는 여러 뇌 구조에서 뉴런과 성상 세포 사이의 거리를 측정합니다. 이 프로토콜은 이전 연구에서보다 두 세 배 더 많은 크기의 세포를 분석 할 수있었습니다.
