Техника ясности, впервые описанная в 2013 году, представляет собой технику очистки тканей, которая позволяет проводить выборку большего количества клеток, кровеносных сосудов, поэтому даже белки такого разрешения одной клетки в толстых срезах мозга. Этот метод позволяет изучать неповрежденные микроскопические структуры, делая весь мозг прозрачным. Этот протокол представляет собой простой чип и прямой конвейер для очистки тканей.
Этот метод может быть использован для очистки тканей в других системах в дополнение к тканям мозга. Для начала запечатайте трубку и колпачок с помощью парапленки и проколите два отверстия в колпачке. Затем перенесите газообразный азот из резервуара с помощью гибкой трубы с внутренним диаметром пять миллиметров и 19-метровой иглой, соединенной на ее конце.
Начните дегазацию, прикрепив трубу к трубе и обеспечив газообмен в течение 30 минут при комнатной температуре. Отсоедините трубу и сразу же заделайте отверстия пластичной глиной. Затем переложите герметичные трубки дегаза в ванну с температурой 37 градусов Цельсия в течение 3 1/2 часов для полимеризации раствора гидрогеля.
Выньте мозг из трубки. Используя лабораторные салфетки, удалите полимеризованный гидрогель вокруг мозга, гарантируя, что остаточный гель не останется прикрепленным к поверхности мозга. Разделите мозг на толстые срезы, которые содержат все области, представляющие интерес.
Поместите ломтики в первый очищающий раствор и инкубируйте при 37 градусах Цельсия с вращением при 70 об/мин в течение 24 часов. А пока подготовьте перфорированную трубку для размещения мозга. Поместите перфорированную трубку в стакан, наполненный вторым очищающим раствором на перемешивающем устройстве.
Затем поместите мозг в стакан и запечатайте его алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить отбеливание. После того, как ткань станет прозрачной, переведите мозг в ПБСТ в инкубации при 37 градусах Цельсия с вращением при 70 об/мин в течение 24 часов. Замените раствор свежим ПБСТ и продолжайте инкубацию еще 24 часа.
Затем переведите мозг на PBS при комнатной температуре в течение 24 часов. Через 24 часа удалите мозг из PBS и переведите его в раствор для сопоставления показателей рефракции. Инкубируйте мозг при температуре 37 градусов по Цельсию в течение ночи.
Сначала поместите образец в середину слайда. Используя горячий клей, создайте стенки по краям горки, почти такие же высокие, как ткань. Обязательно оставьте небольшой зазор в одном из углов.
Когда слой горячего клея приближается к высоте мозгового среза, нанесите одну-две капли раствора, соответствующего показателю преломления, на образец, чтобы увлажнить верхнюю поверхность и предотвратить образование пузырьков. Пока горячий клей еще жидкий, запечатайте верхнюю часть крышкой, поместив ее как можно более равномерно, а затем заполните камеру раствором, соответствующим показателю преломления. Закройте зазор горячим клеем.
Если горячий клей стенок выходит за границы горки, срежьте выдвижные края. Если для визуализации используется масляный погружной объектив, добавьте еще два-три миллиметра клея к стенам над крышкой, чтобы сохранить раствор погружения. После этого протокола ткань мозга будет очищена.
Чистые срезы мозга были подготовлены с использованием этого протокола для визуализации популяций астроцитов и нейронов в области CA1 гиппокампа мыши. Все астроциты экспрессировали tdTomato, а возбуждающие нейроны экспрессировали H2B-GFP в своих ядрах. Камера, подготовленная для осветленной ткани, была оптимальной для визуализации под двухфотонным или конфокальным микроскопом.
Используя двухфотонный микроскоп, более 300 астроцитов наблюдались в очищенном участке области CA1 гиппокампа мыши. Астроциты гиппокампа в красных и пирамидальных клетках, соматы зеленого цвета были видимыми и толстыми, прозрачными тканями, представляющими пространственную близость между этими двумя типами клеток. С помощью сканирующего лазерного конфокального микроскопа аксональные пучки из возбуждающих нейронов были прослежены по всему полушарию.
Зеленые пучки были прослежены от спинного гиппокампа к супермальярным телам. Красные пучки были прослежены от мамиллярных тел к их происхождению в вентиляционном гиппокампе. Такие факторы, как температура, концентрации и время инкубации, повлияли на результат процедуры ясности.
Поэтому точность каждого шага протокола имеет жизненно важное значение для успеха достижения чистой ткани. Используя эту технику, мы измеряем расстояния между нейронами и астроцитами в нескольких структурах мозга. Этот протокол позволил проанализировать на два-три порядка больше клеток, чем в предыдущих исследованиях.
