פרוטוקול זה מאפשר לטהר מתחמי ספטין באיכות גבוהה, וזה חיוני כדי ללמוד את התפקידים הרבים של ספטינים בתא. היתרון העיקרי של גישה זו הוא סינתזה של הליך פשוט כדי לטהר ספטין באיכות גבוהה באמצעות פלסמידים Addgene. ספטינים קשים למחקר בתאים בשל האינטראקציות הרבות שלהם.
שחזור גופרית עוזר לנו לנטרל את המורכבות הזו על ידי לימוד שלהם במערכת פשוטה. אנו ממליצים לעשות טיהור ביום אחד כדי למנוע השפלה. מניסיוננו, זה יגדיל את אורך החיים ואת איכות החלבון.
כדי להתחיל, לגדל את תרבית החיידקים המותמרת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שייקר עד שהצפיפות האופטית באורך גל של 600 ננומטר מגיעה לשניים עד שלושה עבור ספטינים ללא תווית, או 0.6 עד 0.8 עבור ספטינים עם תוויות msfGFP או mEGFP. לאחר הדגירה, השרו את ביטוי החלבון על ידי הוספת IPTG לריכוז סופי של 0.5 מילימולאר ודגירה של התאים המבטאים הטרו-אוליגומרים של ספטין ללא תווית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות, או את התאים המבטאים msfGFP המסומנים כהטרו-אוליגומרים בטמפרטורה של 17 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ואז גלולה את התאים ב 4, 000 פעמים G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
יש להשליך את הסופר-נטנט ולהמיס את הכדור ב-100 מיליליטר של חיץ ליזיס כדי ללכלך את התאים. לאחר מכן, השתמש ב-tip sonicator באמפליטודה של 30% כדי לונתק את התא. להבהיר את התא lysate על ידי צנטריפוגה ב 20, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולשמור את supernatant.
לחלופין, קח דגימה עבור denaturing אלקטרופורזה כמתואר בכתב היד. עבור כרומטוגרפיית זיקה של ספטינים מתויגים שלו, שיווי משקל של עמודת כרומטוגרפיה ארוזה מראש של ניקל ספרוז עם ביצועים גבוהים עם כל המאגרים הנדרשים. טען את הסופרנטנט המובהר עד לעמודה והפעל את מערכת הכרומטוגרפיה.
לאחר מכן, העלו את מתחמי הספטין עם מאגר אלוטיון של 50% HisTrap בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה. כדי להניב ריכוז אימידזול של 250 מילימולר, לאסוף שברים של 0.5 מיליליטר. כעת עקוב אחר הספיגה האופטית של ה-eluate ב-280 ננומטר באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבונים ובחר את השברים המכילים קומפלקסים של ספטין.
עבור כרומטוגרפיית זיקה של חלבונים מתויגים Strep-II שיווי משקל סטורפטקטין ארוז מראש sepharose גבוהה כרומטוגרפיה עמודה עם מאגר septin. לטעון את ספטין המכיל שברים התאושש מעמודת ניקל בקצב של מיליליטר אחד לדקה ולהתחיל את מערכת הכרומטוגרפיה. לאחר מכן שטפו את החלבון הקשור ועימקו את קומפלקסי ספטין עם 100% StrepTrap elution buffer בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה.
כדי להניב ריכוז של 2.5 מילימולר desthiobiotin, לאסוף שברים 0.5 מיליליטר. בחר את השברים המכילים קומפלקסי ספטין כפי שמצוין על ידי הספיגה האופטית של האלואט ב 280 ננומטר המנוטרים באינטרנט עם מערכת כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבונים. לאחר הסרת הדסטיוביוטין על ידי דיאליזה aliquot מתחמי החלבון לגודל האליקוט הרצוי, הקפאו את האליקוט ואחסנו אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס.
למיקרוסקופיה של פיזור אינטרפרומטרי, יש לשטוף את שקופיות הזכוכית מספר 1.5 על ידי ניקוין בחומר ניקוי על-קולי למשך חמש דקות כל אחת במים, איזופרופנול, ושוב במים שעברו דה-יוניזציה. יבשו שתי מגלשות זכוכית עם זרם עדין של גז חנקן. לאחר מכן הניחו טיפת שבעה מיקרוליטרים של תמיסת פולי-ל-ליזין של 0.01% על מרכז אחת השקופיות והניחו את מרכז השקופית השנייה על גבי טיפת Poly-L-ליזין, תוך הכוונת שתי השקופיות בצורה אורתוגונלית להפרדה קלה.
לאחר דגירה למשך 30 שניות, שטפו את המגלשה על ידי טבילה בכוס המכילה מים שעברו דה-יוניזציה פעם אחת ומריחה ישירה של זרם מים פעמיים. ייבשו אותם בזרימת גז חנקן וניתן לאחסן את השקופיות הללו במשך כשישה שבועות בטמפרטורת החדר בתנאים יבשים. לפני הניסוי, חתכו חתיכה של שניים על שניים, שלושה על שניים, או שלושה על שלושה אטמים והדביקו אותם על החלק המטופל בפולי-L-ליזין של מגלשת זכוכית, תוך הימנעות ממגלשת הזכוכית והאטמים הבאים במגע עם כל משטח מלוכלך על ידי הנחת המגלשה על רקמת מגב קלה.
כעת לחץ על האטמים עם קצה פיפטה כדי להדביק אותם עם הפלסטיק המגן שנמצא על האטמים. לאחר מכן, חממו את חיץ המחיצות לטמפרטורת החדר. הפשירו את החלבונים ביד ושמרו אותם על הקרח לאחר מכן.
לאחר מכן הניחו את השקופית עם אטמים על מערכת פוטומטריית המסה המסחרית המכילה 19 מיקרוליטרים של חיץ ספטין ומקד את המיקרוסקופ באמצעות אפשרות המיקוד האוטומטי. מיקוד מחדש עם ההגדרות החדשות, באמצעות אפשרות המיקוד האוטומטי. כדי ליצור תיקיית פרוייקט, לחץ על קובץ ואחריו פרוייקט חדש, וכדי לטעון תיקיית פרוייקט לאחסון נתונים, לחץ על קובץ ולאחר מכן על טען פרוייקט.
ואז פיפטה מיקרוליטר אחד של דגימה ל 19 מיקרוליטר של ירידת חיץ מחיצה. ערבבו, ותוך כדי ערבוב, הימנעו מלגעת בשום דבר כדי למנוע את תזוזת השקופית. לאחר מכן הקלט סרטון 6, 000 פריימים על ידי לחיצה על הקלט.
נתח את הסרטונים באמצעות תוכנת היצרן כדי להשיג את התפלגות מסת החלבון. אם הפסגות של גדלים שונים של ספטין הטרו-אוליגומרים חופפים יותר מדי או יותר מדי אירועים מזוהים להקטין את ריכוז ספטין הסופי ולמדוד שוב. וכאשר לא נמדדות מספיק ספירות של מולקולות בודדות, הגדל את ריכוז המחיצות ומדוד שוב.
לניתוח ספטין, הכינו את ה-5X darkSPB ותערובת ספטין המורכבת מ-100% ספטין כהה בריכוז גבוה פי שישה מהריכוז הסופי הרצוי במאגר ספטין ודיתיותרטיטול מילימולרי אחד. לאחר מכן פילמר את המחיצה על ידי ערבוב מים, תערובת 20%5X darkSPB ו-16.67%septin, בסדר הספציפי הזה, ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הוסיפו שלושה עד חמישה מיקרוליטרים של דגימה לרשת מיקרוסקופיית אלקטרונים זוהרת ודגירה למשך דקה אחת.
כעת, שטפו את הרשת פעמיים על ידי הוספת טיפה של מאגר darkSPB וספגו את הנוזל עם נייר סינון. יש לשטוף פעם אחת במים ולדגור במשך 30 שניות עם 2% אורניל אצטט. לאחר מכן, כתם הכתם ואוויר לייבש את הדגימה במשך כמה דקות.
לאחר מכן תמונה את צרורות septin ב 120 קילווולט והגדלה בין 5, 000X ו 60, 000X עם defocus של אחד עד שני מיקרומטר. הכרומטוגרמה של HisTrap ו-StrepTrap הראתה כי השבר המאוגד עבר מתחילת השיא עד שהספיגה התייצבה על כ-250 מיליליטר ו-50 מיליליטר בהתאמה. רצועות המחיצות הראו עוצמות דומות באלקטרופורזה של ג'ל דנטורציה, מה שמרמז על כך שהמחיצות שלמות.
באלקטרופורזה מקומית נצפו הלהקה העיקרית המתאימה להטרו-אוליגומרים השלמים ולהקה מינורית המתאימה לטרימרים או לטטרמרים. המשקל המולקולרי לכאורה של קומפלקסים מתויגים msfGFP אינו ניתן להבחנה מזה של קומפלקסים לא מתויגים. פוטומטריה המונית זיהתה אוקטאמרים והקסמרים שלמים של ספטינים.
שיא נוסף של 241 קילודלטון הצביע על נוכחותם של שני חלבוני בוטנים, DSep1 ו-mEGFP-DSep2. תמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים של מתחמי ספטין הראו מוטות של הקסמרים ואוקטמרים. תגי msfGFP נראים כצפיפויות מטושטשות בשני הקצוות בספטין 2 msfGFP ספטין אנושי octamers_9i1.
ניתן לצפות בצבירים קטנים של חלבונים בשדה TIRF הרדוד. המיקרוסקופיה הקונפוקלית חשפה אשכולות גדולים של מבנים נימה צפים. מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה הראתה צרורות ספטין קטנים וגדולים המתאימים לצבירים שנצפו על ידי מיקרוסקופיית השתקפות פנימית כוללת ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
אנו ממליצים לעבוד על קרח בכל עת במהלך הטיהורים ולהוסיף ריאגנטים טריים שאנו מציינים בפרוטוקול. אנו מתעניינים באינטראקציות של ספטינים בהקשר של ציטוקינזיס. שחזרנו את ספטין יחד עם ממברנות מודרניות אקטין ומיקרוטובולים כדי לחקור אותם באמצעות מיקרוסקופיה ומספר מבחנים ביופיזיקליים.
אנו משתמשים במחיצות המטוהרות כדי לחקור כיצד ספטינים מתקשרים עם חוטי אקטין, מיקרוטובולים ושומנים. בנוסף, אנו משתמשים במחיצות המטוהרות כדי לבנות תאים סינתטיים שבהם המחיצות מקלות על חלוקת התאים.
