פרוטוקול זה מתאר ייצור של מוטות מיקרו-ג'ל המתחברים לפיגומי מיקרו-נקבוביות. ניתן להשתמש בפיגומים אלה בשילוב עם תאים המספקים את המרחב הדרוש לאינטראקציה יעילה עם התא. שני הסוגים השונים של מוטות מיקרו ג'ל מתחברים זה לזה במגע.
יחס גובה-רוחב גבוה מוביל לנקבוביות גדולות יותר תוך שמירה על יציבות הפיגום תוך שימוש בפחות חומר סינתטי בהשוואה למיקרו-ג'לים כדוריים. פיגומי מיקרו-נקבוביות ישפרו באופן משמעותי את החדירה והאינטראקציה של תאים אנדוגניים לתיקון רקמות פגומות. הנקבוביות הגדולות יקלו על היווצרות כלי הדם כדי להחליף חומרים מזינים לרקמה הגדלה.
הפחתת החומר הפיגום מועילה ככל שיותר שטחים פתוחים מסופקים ליצירת רקמות, דבר החשוב הן ליישומי in vitro והן ליישומי in vivo. היבט קריטי הוא המיקרופיטי על טכניקת השיפוע. כדי להבטיח ייצור רציף של מוטות מיקרו ג'ל, יש להעביר את המוצר ביעילות אל מחוץ לצינור ללא סתימה.
כדי להתחיל, להכניס את המחטים לתוך צינורות פוליאתילן ולהסיר את הגז מן המזרק ואת הצינור. לאחר מכן הכנס צינור פוליאתילן נוסף לתוך השקע לאיסוף המוצר. לאחר מכן, מניחים את כל מזרקי הזכוכית ואת משאבות המזרק ומכניסים כל קצה צינור לכניסה המתאימה.
לאחר מכן, מקד את המיקרוסקופ בחתך מי השמן. הפעל את משאבת מזרק השמן הראשונה כדי למלא את הערוץ בשמן תחילה, כדי למנוע הרטבת ערוץ על ידי השלב המפוזר. לאחר מכן, להקטין את קצב זרימת השמן הראשון ל 30 microliters לשעה ולהתחיל את משאבת מזרק טרום פולימר עד שלב מימי מפוזר ניתן לראות בחתך רוחב.
לאחר מכן, הגדר את קצב הזרימה הטרום פולימרית ל -30 מיקרוליטר לשעה ומקד את המיקרוסקופ בשקע. לאחר מכן, הפעל את משאבת מזרק השמן השנייה והמתן עד שמשטר הזרימה יהיה יציב. מניחים את צינור היציאה במיכל איסוף ומגדירים את מערכת קרינת ה- UV כך שההקרנה תהיה בטווח של 900 עד 1000 מילי וואט לסנטימטר בריבוע.
ונקודת ההקרנה היא חלק הערוץ הישר לפני השקע. לפני הקרנת UV, התאם את קצבי הזרימה של הקדם-פולימר והשמן הראשון כדי להשיג את יחס הגובה-רוחב הרצוי בטווח של 3.0 עד 4.5, והגדר את זמן ההקרנה של הפאזה המפוזרת לכ-2.3 שניות, בהתאם לגודל נקודת ההקרנה. לאחר מכן התחל קרינת UV, ובמידת הצורך, התאם את קצבי הזרימה שוב בהתאם לסעיף הקודם.
לאחר מכן, שנה את מיכל האיסוף וציין את זמן ההתחלה וקצב הזרימה של איסוף המוצרים. כדי לסיים את האיסוף, הסר את הגורם המכיל של האוסף המציין את השעה. לאחר מכן, להפסיק את ההקרנה ואת כל משאבות המזרק.
לאחר מכן יש לשטוף את המוצר חמש פעמים כל אחת עם n-הקסאן, איזופרופנול ומים שעברו דה-יוניזציה. לאחר מכן הסר את supernatant לאחר שקיעת מוט. מעבירים את פיזור הרכיב הראשון לבקבוקון שקוף חרוטי של 1.5 או שני מיליליטר.
לאחר מכן מוסיפים את הרכיב השני באופן מבוקר בפעולה רציפה עם פיפטה של 100 מיקרוליטר ומערבבים את התוכן ישירות באמצעות הפיפטה כדי לקחת נוזל ולהוסיף אותו שוב. לאחר מכן הוסיפו תמיסת G R G D S P C למבנה המקושר כדי לשנות את כל קבוצות האפוקסי הנותרות כאשר פפטיד דבק התא נושא אמין ותיאלי חופשיים ולהשאיר בטמפרטורת החדר למשך הלילה. לאחר מכן, הסר את המולקולות שלא הגיבו על ידי שטיפה במים שעברו דה-יוניזציה והסר את הסופרנטנט.
לאחר הפחתת מפלס המים, פתח את הבקבוקון ומחק עם אור UV באורך גל, 250 עד 300 ננומטר. לאחר מכן סגור את הבקבוקון והעבר את הבקבוקון לספסל נקי. לאחר מכן, יש לשטוף במים סטריליים.
החליפו את המים בבקבוקון במדיה של תרבית תאים ואפשרו שיווי משקל למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו את הפיגום המאקרו-נקבובי לצלחת באר של תרבית תאים לצורך הניסוי על ידי מזיגה או שימוש במרית. מיקרוסקופיה קונפוקלית גילתה כי המבנה המאקרו נקבובי התלת-ממדי היה מורכב ממוטות מיקרו-ג'ל פונקציונליים של אמין ואפוקסי.
המבנה מציג גיאומטריה קומפקטית של כ -10, 000 מוטות מיקרו ג'ל שנוצרו תוך שתיים או שלוש שניות. המודולוס של מוטות מיקרו-ג'ל אמין ואפוקסי מבית Effective Young יחד עם כדורי מיקרו-ג'ל אמין ואפוקסי נמדד על ידי כניסת ננו. כדי לזהות קבוצות פונקציונליות פעילות, ניתן להשתמש בפלואורסצין ISO thiocyanate כדי להמחיש קבוצות אמינו ראשוניות ואיזומר אמין פלואורסצין ניתן להשתמש כדי לסמן קבוצות אפוקסי.
למוטות מיקרו ג'ל אמין יש ממדים עם אורך ממוצע של 553 מיקרומטר ורוחב ממוצע של 193 מיקרומטר במים שעברו דה-יוניזציה, וכתוצאה מכך יחס גובה-רוחב של כ-3.0. הערכים הממוצעים של נקבוביות המאקרו והפיגומים המורכבים ממוטות מיקרו ג'ל הם 100 מיקרומטר, כאשר 90% מגודל הנקבוביות נע בין 30 מיקרומטר ליותר מ-150 מיקרומטר. הכדור, כמו מיקרו-ג'לים, יוצר אשכולות עם גודל נקבוביות בין 10 ל-55 מיקרומטר, עם ערך ממוצע של כ-22 מיקרומטר.
מוטות המיקרו-ג'ל המתוארים נועדו לייצר פיגומי מיקרו-נקבוביות המקושרים זה לזה על ידי ערבוב אקראי. הליך ערבוב מבוקר עשוי לאפשר ייצור של גיאומטריות פיגומים מותאמות יותר בעתיד. ניתן לגוון את הנוקשות של המיקרו-ג'לים ואת הרמזים הביוכימיים בהתאם לדרישות המכירה.
על ידי שילוב אבני בניין שונות ניתן להשיג מגוון רחב של גיאומטריות ותכונות בתוך פיגום אחד. בדרך זו אנו יכולים להתמקד בתאים ספציפיים ביעילות כדי ליצור רקמות רב-תאיות.
