בסרטון זה מתואר פרוטוקול ליצירה ושימוש בפיגומי אלגינט מקרו-נקבוביים יבשים המכונים Drydux המקדמים ביעילות התמרה של תאי T פעילים. Drydux מיועד לשימוש במקום ספינוקולציה בתקן זהב של צלחות מצופות רטרו-נקטין שנזרעו בווירוס ומפשטת את תהליך התמרת התאים. ל-Drydux יש יעילות התמרות הדומה לספינוקולציה על לוחות מצופים רטרו-נקטין, והיא משמשת כחלופה זולה ונוחה יותר לשיטת ההתמרות הקונבנציונלית.
ראשית, הכינו תמיסה של 0.4% של סידן-D-גלוקונט. הוסיפו מי DI מסוננים סטריליים לסידן-D-גלוקונט בכוס. יש לערבב במהירות בינונית עד שהסידן-D-גלוקונאט מתמוסס, פעולה שנמשכת כשעה וחצי.
לאחר ההמסה, מסננים סטרילי את תמיסת הסידן-D-גלוקונט. ניתן לאחסן תמיסה זו בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו פתרון של 2% אלגינט.
ניתן להשיג זאת באמצעות בקבוקון מכסה בורג, או. שניהם יוצגו כאן. בזהירות להוסיף את אלגינט ultrapure לכלי.
מוסיפים את הכמות המתאימה של מי DI לאלגינט. בחר את סרגל הערבוב הגדול ביותר האפשרי שלא יעכב ערבוב והוסף אותו לכלי. מערבבים את התמיסה על גבוה עד אלגינט מתמוסס, אשר לוקח בערך שעה.
אם יש גושים אלגינטיים גדולים בצד הכלי, הטה את כלי השיט הצידה כדי לעקור אותם. גושים קטנים יתמוססו במשך שעה, ואינם סיבה לדאגה. לאחר שהתמיסה של 2% אלגינט מתמוססת, הפחיתו את מהירות הערבוב.
הוסיפו באיטיות נפח שווה של תמיסת הסידן-D-גלוקונאט לתמיסת האלגינט. הוספתו באיטיות תסייע למנוע היווצרות גושים צולבים. לאחר הוספת תמיסת הסידן-גלוקונט, הגבירו את מהירות הערבוב, וערבבו במרץ במשך 15 דקות.
הטה את הכלי הצידה כדי להסיר גושים שאולי נוצרו. לאחר ערבוב נמרץ במשך 15 דקות, ודא שאין גושים בתמיסה. צנד את התמיסה לצלחת של 48, או 24 בארות.
עבור צלחת 48 באר, פיפטה 300 מיקרוליטר לתוך כל באר. הקפידו להטיל לאט ולהחליף טיפים לעתים קרובות, שכן הפתרון יהיה צמיג, ועלול להיצמד לקצה. עבור צלחת של 24 בארות, פיפטה מיליליטר אחד לתוך כל באר.
שוב, יצקו לאט, והחליפו טיפים לפיפטה לעתים קרובות. מכסים את צלחות הבאר במכסה, ומקפיאים בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הכינו את הצלחות לליופילייזר על ידי הסרת המכסים ואבטחת החלק העליון באמצעות מגבונים וגומיות.
מניחים את הצלחות בצינור lyophilizer, ולשים על lyophilizer במשך 72 שעות. לאחר 72 שעות, להסיר את הצלחת מן lyophilizer. הפיגומים מוכנים כעת לשימוש לצורך התמרת.
אם לא משתמשים בפיגומים באופן מיידי, אטמו את הצלחת עם Parafilm ואחסנו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד הצורך. לאחסון לטווח ארוך, מומלץ לאטום את הצלחת בוואקום בנוסף לאיטום עם Parafilm. רכז סופרנטנט ויראלי על ידי צנטריפוגה של שני מיליליטר של תמיסה ויראלית דרך מסנן צנטריפוגלי ב 1, 500 גרם במשך 10 דקות.
יש צורך ב-100 עד 200 מיקרוליטרים של נגיף מרוכז לכל פיגום. סובבו במשך מספר דקות נוספות אם נפח תמיסת הנגיף המרוכז גדול מ-200 מיקרוליטר. עבור כל פיגום, הכינו אליקוט של מיליון תאי T פעילים התלויים ב-50 מיקרוליטרים של תרבית תאים שלמה.
הוסף את הנגיף המרוכז לתרחיף התא. הנפח הכולל של תרחיף נגיף התא לא יעלה על 200 מיקרוליטר עבור פיגום 48 באר, או 350 מיקרוליטר עבור פיגום 24 באר. הוסיפו את תערובת נגיפי התאים לחלק העליון של הפיגום היבש.
עבור ניסויי בקרה שלילית, השתמש במדיה מלאה של תרבית תאים במקום בנגיף מרוכז. הוסיפו את מתלה התא הזה לחלק העליון של הפיגום היבש. לדגור את הפיגומים בחממת תרבית התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 עד 60 דקות.
מוציאים את הפיגומים מהאינקובטור. הפיגומים אמורים לספוג את התמיסה במלואה בתקופה זו. כדי לגרום להתפשטות, הוסיפו לכל באר תרבית תאים מלאה בתוספת IL-7 ו-IL-15.
IL-2 יכול לשמש גם. עבור פיגום 24 בארות, להוסיף מיליליטר אחד. עבור פיגום 48 בארות, להוסיף 500 microliters.
דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות. התאים יתרבו במשך 72 השעות, מה שעשוי להפוך את המדיה לכתומה. הסר עודפי מדיה מכל באר.
כדי לבודד תאים מהפיגום, יש להוסיף תמיסת EDTA טוחנת 0.25 לכל פיגום. הוסף מיליליטר אחד עבור פיגומים של 24 בארות, או 300 מיקרוליטר עבור פיגומים של 48 בארות. תנו לצלחת לשבת, או התסיסו בעדינות במשך שלוש עד ארבע דקות.
לאחר שהתמוסס ברובו, פיפטה פנימה והחוצה בעדינות בתוך הבאר. ייתכן שיהיה צורך בכמה שלבי צנרת פנימה והחוצה כדי להמיס את הפיגום במלואו. העבר את הפתרון לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.
לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. הוסף 12 מיליליטר של PBS לכל צינור צנטריפוגה. צנטריפוגה ב 400 גרם במשך חמש דקות.
כדור תא ייווצר בתחתית הצינור. שאפו את התמיסה הסופר-טבעית, וחזרו על הכביסה. יש להיזהר בהסרה מלאה של הסופר-נטנט עם כל שטיפה, שכן חיוני להיפטר מכל ה-EDTA.
לאחר שטיפה עם PBS בפעם השנייה, כדור התא מוכן לניתוח. ציטומטריה של זרימה שימשה לקביעת יעילות ההתמרה של כל קבוצה. תאים שאינם מתמרים שימשו כבקרה שלילית, ולא הראו התמרת.
גם תאים שנזרעו על פיגומים ללא רטרו-וירוס GFP לא הראו התמרת. קבוצת Drydux, שהפעילה תאים שנזרעו על פיגומי אלגינט מקרו-נקבוביים יבשים, הראתה התמרה של 85%, מעט נמוך יותר מקבוצת הרטרו-נקטין. תוצאות אלה מראות כי פיגומי Drydux מתמרים ביעילות תאים על ידי העברת גנים רטרו-ויראליים ללא צורך בספינוקולציה של לוחות מצופים רטרו-נקטין.
פיגומי Drydux מפגינים יעילות התמרה גבוהה הדומה לרטרונקטין, ומספקים שיטה חלופית להתמרת תאי T. בשל העלות הנמוכה של ייצור פיגומי Drydox, לתהליך זה יש פוטנציאל להוזיל משמעותית את העלות של טיפולים בתאי T של CAR.
