שיטה זו מציגה דרך ליצור פיגומים שמקורם ברקמה מקומית אשר ניתן להשתמש בהם להתחדשות הסחוס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי מרכיבים של הסחוס המקומי נשמרים בפיגומים שיכולים לקדם היווצרות סחוס והתחדשות במבחנה ו in vivo. למרות ששיטה זו משתמשת בסחוס ממפרקי מחניק סוסים, ניתן להשתמש גם בסחוס מכל מפרק אחר.
כדי להתחיל, להשיג מפרק גווייה שלם לבידוד סחוס ולהסיר את העור עודף שומן רקמת שריר כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, הגדר את המיקום שבו המפרק מתבטא על ידי ביצוע פיתול הרחבה של המפרק. בצע חתך אופקי כדי להגיע לחלל המפרקים.
לאחר מכן, בצע חתך אנכי כדי לפתוח את אזור המפרקים. חלל המפרקים מלא בנוזל סינוביאלי אשר צפוי לטפטף מהחלל בעת ביצוע חתך נכון. המשך לפתוח את המפרק לחלוטין על ידי הסרת שומן מוגזם, שרירים וגידים, ועל ידי חיתוך דרך הגידים לשמור על המפרק יחד.
בדוק בזהירות את הסחוס לכל נזק מקרוסקופי. אם הסחוס המחשוף אין מראה חלק מבריק יותר או אם ראיות, שלפוחיות, שסועים או פגמים קיימים, להשליך את הסחוס ולהתחיל שוב. השתמש אזמל סטרילי כדי להסיר את הסחוס מן העצם.
חותכים את כל הדרך עד לעצם subchondral כדי להסיר את הסחוס באזור עמוק. אסוף את פרוסות הסחוס שהוסרו בצינורות 50 מיליליטר המכילים פתרון שטיפת סחוס שהוכן בעבר. בזמן המעובד, מטפטף באופן קבוע תספורת שטיפת סחוס על הסחוס כדי למנוע את הסחוס להתייבש.
לאחר איסוף הסחוס מכל תחומי העניין, יש להקפיא את פרוסות הסחוס בחנקן נוזלי למשך חמש דקות. לאחר מכן מעבירים את פרוסות הסחוס לצינורות 50 מיליליטר ומיד הניחו את הפרוסות הקפואות במייבש הקפאה. ליופיליזציה של פרוסות הסחוס למשך 24 שעות עם מייבש ההקפאה.
בסיום, יש לאחסן את פרוסות הסחוס המיובשת במקום יבש בטמפרטורת החדר. לעיבוד ידני, יש לצנן מראש מרגמה ועלי עם חנקן נוזלי, ולאחר מכן מניחים את פרוסות הסחוס הליופיליות במכתש ומטביעים אותן וחנקן נוזלי. ישירות לטחון את הדגימות ביד במשך כ 45 דקות עד שהם מרוסקים מספיק.
לחלופין, כדי לטחון את הדגימות באופן אוטומטי באמצעות מכונת כרסום, להתחיל על ידי קירור מראש את תא הטחינה של מכונת הטחינה על ידי הוספת חנקן נוזלי. לאחר מכן מוסיפים את פרוסות הסחוס lyophilized וטחנים את המדגם במהירות קבועה מראש שלו במשך כמה שניות עד דקה. ודא כי כל החלקיקים הם הקרקע, כי אין חלקיקים להישאר בחלק התחתון של תא שחיקה.
לבסוף, בצע יחד עם טכניקת decellularization המתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה לפני יצירת פיגומים. מעבירים את חלקיקי הסחוס עם תווית קטנה לתבנית פלסטיק גלילית. לחץ על כל בועות האוויר החוצה כדי למנוע חללים בפיגום ולמלא את התבנית לחלוטין.
כדי למנוע חללים בפיגומים, ודא כי בועות אוויר לחוצים החוצה תוך מילוי התבנית עם חלקיקי סחוס. לאחר היווצרות, להקפיא את התבנית במשך 10 דקות במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן ליופילים את פיגומים הסחוס בתוך התבנית במשך 24 שעות במייבש הקפאה.
לאחר ליופיליזציה, בזהירות להסיר את הפיגום מן התבנית. מניחים את הפיגום תחת אור UV באורך גל של 365 ננומטר ומצליבים אותו בן לילה. יוצרים דיסקי פיגומים על ידי חיתוך פיגומים מעוקרים לפרוסות בעובי 3 מ"מ.
ואז להעביר את הפיגומים לתוך בארות נפרדות של צלחת שש באר. מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום הרחבת כונדרוציט על גבי הפיגומים ומאפשרים להם להתייבש במשך 30 דקות. בעוד הפיגומים rehydrate, להכין את התאים ואת פיפטה 50 microliter של ההשעיה התא מוכן על גבי פיגום ספוג מראש.
ואז לה הדגירה את הפיגום במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. בעת שימוש בכונדרוציטים, ודא שהם לא הורחבו מעבר למעבר הראשון כדי למזער את מספר התאים המובחנים. לאחר שעה, להחזיר את הצלחת למכסה המנוע התרבותי בזהירות להפוך את הפיגום מעל.
פיפטה 50 microliters הנותרים של השעיית תא על הפיגום דגירה במשך שעה נוספת ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, מוסיפים שלושה מיליליטר של בינוני ל בארות עם פיגומים. הימנע צינורות המדיום ישירות על הפיגומים ולטפל צלחת התרבות בעדינות, כדי למנוע ניתוק של התאים.
מחזירים את הצלחת לאנקובטור ולתא התרבות עם פיגומים ב-37 מעלות צלזיוס. שילוב של כתמים היסטוריים וכימות DNA שימשו כדי להראות כי השיטות המוצגות במאמר זה לגרום decellularization פיגום סחוס מספיק. הפיגומים וכתוצאה מכך נמצאו לא מכילים תאים יחד עם רמות בלתי ניתנות לגילוי של DNA.
הם גם חסרים glycosaminoglycans והם עשירים קולגן II.Here, היווצרות מטריצה ניאו נצפתה על פיגומים ceded עם תאי גזע mesenchymal כי היו מתורבתים במשך ארבעה שבועות. היווצרות הגליקוזאמינוגליקנים שופעת לאחר ארבעה שבועות. לאחר ניסיון הליך זה, חשוב לבחון אם דפלולריזציה הצליחה, לפני השימוש בו בכל יישום.
בעקבות הליך זה, ניתוח ביוכימי נוסף כמו מנתח כתם מערבי יכול להתבצע על מנת לענות על שאלות ספציפיות על נוכחותם של רכיבים אחרים כגון גורמי גדילה. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנדסת הרקמות לחקור אסטרטגיות להתחדשות סחוס באמצעות רקמה דפלולרית ממקורות אלוגניים וסינגן. אמצעי זהירות כגון לבישת חלוק מעבדה וכפפות תמיד יש לנקוט.
