הפרוטוקול שלנו הוא שיטת in vivo כדי לחקור את הפונקציות האוטונומיות התאיות של FMRP במהלך הפיתוח. זה יכול לעזור להבין את הפתופיזיולוגיה הספציפית לסוג התא של תסמונת X שביר. שיטה זו משתמשת באלקטרופורציה ספציפית לשלב, לאתר ולכיוון של מערכת וקטורית הניתנת להשראה של תרופה המכילה RNA קטן של סיכות שיער Fmr1.
בשיטה זו, אנו משיגים את ההדחה הסלקטיבית של FMRP במעגל השמיעתי. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם כדי לחקור את תפקודם של גנים אחרים במעגל השמיעה או במערכת שיווי המשקל. מתחילים בהנחת הביציות בצורה אופקית כדי למקם את העובר על החלק העליון של הביצית למניפולציה קלה.
דגירה ב 38 מעלות צלזיוס במשך 46 עד 48 שעות עד המבורגר והמילטון, או HH שלב 12, עבור transfection של התעלה העצבית או במשך 54 עד 56 שעות עד HH 13 עבור transfection otocyst. מוציאים את הביצים מהאינקובטור, תריסר ביצים בכל פעם. הרחקת ביצים מהאינקובטור שלהן למשך יותר משעה יוצרת שינויים התפתחותיים ומפחיתה את הכדאיות.
השתמשו בפנס כדי להטיל אור מתחתית הביצה. מיקום העובר מופיע כאזור כהה על קליפת הביצה. סמן את מיקום העובר על קליפת הביצה בעיפרון.
נגבו את הביצים בגזה המכילה 75% אתנול וקדחו חור בקצה המחודד של הביצים בעזרת קצה המספריים. לאחר מכן, הסר שני מיליליטר של אלבומין עם מזרק מחט 18 מד. ודא שהחור גדול מספיק כדי לאפשר את החדרת המחט.
נגבו כל אלבומין דולף עם גזה וסתום את החור בנייר דבק שקוף. מכסים את החלק העליון של הביצים בנייר דבק שקוף, במרכזו האזור הכהה המסומן בעיפרון כדי למזער סדקים ולמנוע נפילת פסולת קליפה במהלך החלון. נגב את כל כלי הניתוח עם גזה המכילה 75% אתנול ונגב את האזור המכוסה בסרט עם 75% אתנול.
השתמש בזוג מספריים קטן כדי לחתוך חלון של סנטימטר מרובע אחד עד שניים סביב היקף סימן העיפרון. החזיקו את המספריים שטוחים כדי למנוע פגיעה בעובר שמתחת. הניחו את ביצת החלון מתחת לסטריאומיקרוסקופ עם חתיכת עין 10X וזום 2X.
מלא מזרק של מיליליטר אחד בתמיסת הדיו ולאחר מכן התאם מחט של 27 מדים. כופפו את המחט לזווית של 45 מעלות בעזרת מלקחיים. מתחת למיקרוסקופ, לתקוע בזהירות מקצה האזור opaqua ולהחדיר את המחט מתחת לעובר.
להזריק כ-50 מיקרוליטרים של דיו, שיתפזרו מתחת לאזור פלוצ'ידה, להדמיית עוברים. הדיו יהווה רקע כהה להדמיה ברורה של העובר. משוך נימי זכוכית לתוך פיפטות באמצעות מושך פיפטה.
תחת מיקרוסקופ גזירה, יש לפתוח בזהירות את קצה המחט הנימית לקוטר של 10 עד 20 מיקרומטר בעזרת מלקחיים. אחסנו את הפיפטות בקופסת אחסון עד לשימוש. לאחר מכן, למלא פיפטה נימי עם 0.5 עד 1 microliters של תערובת פלסמיד על ידי הפעלת לחץ שלילי דרך צינור גומי בסוף פיפטה עם מזרק.
מניחים את הביצית מתחת למיקרוסקופ כך שהעובר מכוון אנכית עם הזנב קרוב אליך. החזיקו את הפיפטה הנימית ביד אחת או עם מניפולטור שלושת הצירים והניעו את קצה הפיפטה לרמבומר 5 עד 6. בכיוון זנב-אל-ראש.
בעדינות לדחוף את הקצה דרך קרום ויטלין לתוך הצינור העצבי הגבי, ולאחר מכן למשוך את פיפטה קצת כך הקצה הוא לומן של הצינור העצבי. הזריקו את תערובת הפלסמיד על ידי הפעלת לחץ אוויר עד שהפלסמיד הכהה מתפזר במלואו לתוך רומבומרים 5 עד 6 ומתרחב לתוך רומבומר 3 ורומבומר 4. בדוק הזרקה מוצלחת, אשר מושגת כאשר תמיסת הפלסמיד הכחולה מתפזרת במהירות במורד הצינור העצבי מבלי לדלוף.
כאשר מתרחשת דליפה, הכחול דוהה במהירות. מיד לאחר ההזרקה, מניחים אלקטרודה דו קוטבית פלטינה משני צדי הצינור העצבי. ספק שתי פעימות של 12 וולט ומשך 50 אלפיות השנייה עם אלקטרופורטור.
שימו לב לבועות אוויר בקצות האלקטרודה הדו קוטבית, עם יותר בצד השלילי. בדוק אם אלקטרופורציה מוצלחת, אשר מושגת כאשר תערובת פלסמיד כהה נכנס לרקמת הצינור העצבי ליד הצד החיובי של האלקטרודה. לאחר אלקטרופורציה, להסיר בזהירות את האלקטרודה דו קוטבית.
מכסים את החלון על קליפת הביצה בחתיכת סרט שקוף שנחתכים מראש לריבועים של שני סנטימטרים ומרוססים ב-75% אתנול. החזירו את הביצה לאינקובטור שלה. נקו את האלקטרודה הדו קוטבית על ידי העברת 10 עד 20 פולסים של 12 וולט ומשך 50 אלפיות השנייה במלח לפני שתמשיכו לביצה הבאה.
מתחת למיקרוסקופ, מניחים את הביצית באופן כזה שהעובר אנכי עם הזנב לידך. החזיקו את הפיפטה הנימית ותקעו בעדינות את האוטוציסטה הימנית בכיוון הדורסולטרלי. להזריק את תערובת פלסמיד עם לחץ אוויר עד otocyst מתמלא תמיסה כחולה.
בדוק אם יש הזרקה מוצלחת, אשר מושגת כאשר תערובת הפלסמיד הכחול כלואה בתוך האוטוציסט ואינה דולפת. מיד לאחר ההזרקה, מניחים את האלקטרודה הדו קוטבית על האוטוציסט ומניחים את הצדדים החיוביים והשליליים הקדמיים והאחוריים לאוטוציסט, בהתאמה. ספק שתי פעימות של 12 וולט ומשך 50 אלפיות השנייה עם האלקטרופורטור.
בדוק אם אלקטרופורציה מוצלחת, אשר מושגת כאשר תערובת פלסמיד כחול נכנס לרקמה של otocyst ליד הצד החיובי של האלקטרודה. לאחר electroporation, בזהירות להסיר את האלקטרודה דו קוטבית לכסות את החלון על קליפת הביצה עם סרט שקוף. לבסוף, להחזיר את הביצה לאינקובטור.
התמונה המייצגת מציגה דוגמה ליום העוברי השלישי, או E3, לאחר העברת צינורית נוירו וטיפול דוקס ביום העוברי השני, או E2. תאים שעברו טרנספקציה עם Fmr1 shRNA ו- EGFP בחתך מוצגים כאן. תאים המבטאים EGFP היו מוגבלים לצד אחד של התעלה העצבית וגזע המוח. חתך רוחב ב-E15 עם גרעין מגנוצלולריס המבטא EGFP, או נוירוני NM, בצד הטרנספקטיבי מוצג כאן.
בצד הנגדי, אקסונים המכילים EGFP נצפו בחלק הגחוני של גרעין הלמינריס, או NL. ההשפעה של Fmr1 shRNA אומתה על-ידי הפחתה ניכרת בפעילות החיסונית של FMRP בנוירוני NM שעברו טרנספקציה בהשוואה לנוירונים שכנים שאינם מותמרים. הגנגליון השמיעתי ב- E19 עם פעילות חיסונית FMRP מוצג כאן. נוירונים של גנגליון שמיעתי לא הועתקו.
חלק מתאי הגליה שמקורם בתאי הצמרת העצבית הגולגולתית עברו טרנספקציה. התמונות המייצגות מראות נפילת FMRP בצינור השמיעה לאחר העברת אוטוציסט. צינורות השמיעה ב- E9 הציגו פלואורסצנציה נרחבת של EGFP.
בקטעים רוחביים, תאים המבטאים EGFP היו ממוקמים בפפילה הבזילרית ובגנגליון השמיעתי. ההשפעה של Fmr1 shRNA אומתה על ידי פעילות חיסונית מופחתת של FMRP בתאי שערה שעברו טרנספקציה, בהשוואה לתאי שיער שכנים שאינם מותמרים. באופן דומה, הפעילות החיסונית של FMRP פחתה במידה רבה בתאי עצב של גנגליון שמיעתי.
ההקרנה המרכזית של נוירוני הגנגליון השמיעתי הטרנספקטיביים הייתה במעקב אחר גזע המוח דרך עצב השמיעה עם מסופי אנדבולב מאופיינים. בעת ניסיון הליך זה, הדבר החשוב ביותר הוא לשלוט על האתר ואת הכיוון של electroporation עבור transfection סלקטיבי. לאחר הליך זה, ניתן לבצע מילוי מסוג תא בודד, אימונוסטינינג, מיון תאים ואחריו ספקטרום מסה, או ריצוף של תא בודד כדי לחשוף את השינויים ברמות המורפולוגיות והביוכימיות.
טכניקה זו מאפשרת גם עריכה סלקטיבית של גנים אחרים עם בקרה טמפורלית וספציפיות רכיבים באוזן השמיעתית עבור מעגלי גזע וניתן לשנות אותה כדי לתפעל את מערכת שיווי המשקל.
